《Bioresource Technology Reports》：Microbial steering in psychrophilic fermentation of food waste: Bioaugmentation as a tool for butyric acid enrichment
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Reema Kumar|Bikash Ranjan Tiwari|Guneet Kaur|Satinder Kaur Brar加拿大安大略省多伦多市约克大学拉松德工程学院土木工程系摘要本研究探讨了在低温条件（17℃）下，利用丁酸梭菌进行生物强化处理对食物垃圾厌氧发酵过程中挥发性脂
Reema Kumar|Bikash Ranjan Tiwari|Guneet Kaur|Satinder Kaur Brar
加拿大安大略省多伦多市约克大学拉松德工程学院土木工程系
摘要
本研究探讨了在低温条件（17℃）下，利用丁酸梭菌进行生物强化处理对食物垃圾厌氧发酵过程中挥发性脂肪酸生成及微生物群落动态的影响。实验采用从厌氧消化污泥中提取的混合培养物，并分别进行有生物强化和无生物强化的批次试验。经过生物强化的系统，其挥发性脂肪酸浓度最高可达4.59克/升，是对照组的2倍多，其中丁酸含量更是比对照组高出5.3倍。值得注意的是，生物强化组中丁酸的选择性上升至36.4%，而对照组仅为20.2%。由于产乙酸细菌的竞争作用，两种系统中乙酸依然是主导酸类。16S rRNA测序结果显示，生物强化组中的微生物结构发生了显著变化，丁酸梭菌和抑制肉杆菌的数量持续增加。丁酸梭菌的丰度与丁酸浓度之间存在显著的斯皮尔曼相关性（ρ=0.631，p=0.028），这表明丁酸梭菌在提高丁酸生成方面发挥了重要作用。冗余分析显示，微生物群落的变化与丁酸生成密切相关，高丁酸含量的样本在主坐标轴上呈现出独立的聚集趋势，这一现象反映了低温条件下生物强化的作用。相比之下，对照组在后期出现了更多假单胞菌物种以及未分类的微生物，这说明其群落结构较差，代谢效率也较低。总体而言，这些研究结果证明了在低温混合培养条件下，通过靶向生物强化可有效提升丁酸的生成量，同时也为了解低温发酵过程中驱动代谢结果的群落间相互作用提供了依据。
引言
近年来，作为循环生物经济理念的一部分，通过厌氧发酵将有机废弃物转化为挥发性脂肪酸等高附加值产品越来越受到重视。然而，在混合培养系统中优化特定挥发性脂肪酸，尤其是丁酸的生成，仍然面临诸多挑战，因为这类系统由于微生物间的竞争、代谢交叉作用，以及对温度、底物类型和pH值等操作条件的敏感性而变得极为复杂（Atasoy等人，2024年）。丁酸因其广泛的用途而在化学、制药和食品工业中备受青睐（Agnihotri等人，2022年）。传统上，丁酸是通过石化路线或纯培养发酵生产的（Kelbert等人，2024年）。不过，利用废弃物作为底物并结合多种微生物共同作用，则是一种更为可持续的替代方案。问题在于，多种微生物途径会争夺相同的中间产物，从而导致难以保持选择性。在这样的系统中，丁酸的产量和选择性往往受到那些无法有效引导碳流向丁酸生成途径的功能性微生物群体的缺乏或活性不足的限制（Romans-Casas等人，2023年）。在此背景下，生物强化技术——即有意引入功能性微生物菌株——便成为一种有望引导代谢途径朝着目标产物生成的策略。
生物强化技术已在各种废水处理和发酵过程中得到成功应用，用于提升污染物降解效率（Cheng等人，2021年；Tripathi等人，2021年）、甲烷生成效率（Giangeri等人，2024年；Linsong等人，2022年），以及最近的挥发性脂肪酸生成效率（Atasoy和Cetecioglu，2021年；Murali等人，2021年）。在厌氧发酵过程中，这一方法可通过引入能够加速限速步骤或强化目标代谢途径的特化菌株，来改善微生物群落的稳定性。关键微生物种群的存在不仅提升了底物转化效率，还减少了不希望出现的副产品的积累，进而提高了工艺的稳定性和产出一致性。尽管生物强化技术在提升丁酸生成方面具有潜力，但目前大多数相关研究都是在中温条件下进行的，所使用的底物包括污泥、奶酪工业废水、稻草和甘蔗渣等（Atasoy等人，2020年；Díez等人，2025年；Eder等人，2020年）。有研究显示，在中温条件下，当使用丁酸梭菌这类微生物时，由于它们具备强大的丁酸生成能力，因此能提高产量（Atasoy和Cetecioglu，2020年；Fu等人，2022年；Sim等人，2022年）。这类微生物能够将多种碳水化合物发酵为丁酸，而且在复杂的发酵环境中即便面对环境变化也能保持稳定，不会被生长更快的微生物取代（Zhang等人，2019年；Fang等人，2021年）。此外，中温和高温条件下的发酵过程需要大量的能量用于加热反应器，这可能会限制大规模挥发性脂肪酸生产的经济可行性，尤其是在那些维持较高温度需要大量能源的寒冷地区。而且，大多数在中温条件下的优化研究都侧重于提高挥发性脂肪酸的浓度，而非评估在实际废物管理系统中，受各种操作条件限制时的工艺性能。在食物垃圾和污水污泥等实际废弃物中，底物组成的差异性和原有微生物多样性的存在，进一步增加了保持丁酸生成菌优势的难度。在低温条件下（≤20℃），微生物的代谢活性本来就较低，因此涉及此类条件下的生物强化效果的研究十分少见，而且目前相关研究大多集中在利用生物强化技术提升厌氧消化过程中的生物气产量上（Fu等人，2022年）。在我们之前针对食物垃圾开展的研究中（Kumar等人，2025年），低温条件有助于更长时间地维持丁酸的产生，从而为采取针对性措施提供了可能。微生物多样性分析显示，其中占比最高的细菌属为类芽孢杆菌属、溶芽孢杆菌属、孢囊杆菌属、芽孢杆菌属和乳酸杆菌属。不过，这些细菌在发酵过程中的主要功能和特性包括耐寒性、蛋白酶产生能力、固氮能力以及抗菌物质产生能力（Beno等人，2020年；Kharadi等人，2020年；Seldin，2011年）。这些特性有助于丁酸生成菌通过水解作用产生丁酸。在样本中发现的已知丁酸生成菌中，有一些属于丁酸梭菌属。虽然丁酸梭菌属的微生物数量并非最多，但它们是被认定为该微生物群落中的固有成员，具备合成丁酸的能力。这类微生物能够利用复杂的底物来生成丁酸，而且还能耐受协同发酵环境（Kumar等人，2025年），因此很适合作为生物强化的候选菌株。
在本研究中，我们针对现有文献中的这一空白，探讨了在处理食物垃圾的低温混合培养发酵系统中，利用丁酸梭菌作为生物强化剂来提升丁酸生成量的可能性。选择这一菌株是基于我们之前的研究（Kumar等人，2025年）以及其他相关研究（Atasoy和Cetecioglu，2020年），同时还考虑到了它与现有微生物群落的兼容性（Zhang等人，2023年）。此外，丁酸梭菌能够耐受低温，且在自然环境和与食物相关的环境中常常与丁酪丁酸梭菌共存，这表明它们具有生态兼容性，这一点也有相关研究予以证实（Driehuis等人，2016年；Yang等人，2022年）。我们并非在发酵的整个过程中持续或早期就引入丁酸梭菌，而是根据之前的微生物群落分析结果，在特定的发酵阶段才加入该菌株。本研究所处的低温且偏碱性的环境，再加上所采用的生物强化策略，使其有别于以往的研究，也使得我们能够评估这种靶向生物强化技术在真实废弃物处理中的应用效果。通过研究微生物动态、挥发性脂肪酸组成以及群落变化，本研究有助于开发出更为可控、高效的发酵工艺，从而实现从有机废弃物中选择性生成挥发性脂肪酸的目标。
章节节选
丁酸梭菌纯培养物的制备
为了获得丁酸梭菌的纯培养物，我们在无菌条件下准备了液态和固态（添加琼脂的）强化梭菌培养基（RCM，由美国密苏里州圣路易斯的Millipore Sigma公司提供）。每升培养基的典型成分包括：肉提取物10.0克、蛋白胨10.0克、酵母提取物3.0克、D(+)-葡萄糖5.0克、淀粉1.0克、氯化钠5.0克、醋酸钠3.0克以及L-半胱氨酸盐酸盐0.5克。制备好的培养基的pH值为
生物强化对挥发性脂肪酸生成的影响
图1展示了通过检测总挥发性脂肪酸和各类单独挥发性脂肪酸的生成量，所得到的关于生物强化效应的结果。经过生物强化的系统中，整体挥发性脂肪酸浓度升高至4585毫克/升（约5.8克COD/升），这一数值是对照组2089毫克/升（约2.3克COD/升）的2.2倍。挥发性脂肪酸总量的增加也与生物强化组中SCOD值的上升相一致（见图2）。通过进行双因素方差分析来检验
结论
在食物垃圾的低温厌氧发酵过程中，利用丁酸梭菌进行生物强化处理，显著提升了丁酸的生成量，并改变了微生物群落的动态结构。经过强化的系统，其挥发性脂肪酸浓度峰值可达4.6克/升，其中丁酸含量为1.4克/升。与非强化系统相比，丁酸的选择性提升到了36.4%，而非强化系统仅为20%。包括丁酸梭菌和抑制肉杆菌在内的关键微生物种类数量增加，而其他竞争性微生物则被抑制。在发酵初期，
CRediT作者贡献说明
Reema Kumar：负责原文撰写——初稿编写、数据可视化、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构思。Bikash Ranjan Tiwari：负责原文撰写——审阅与编辑、结果验证、方法设计。Guneet Kaur：负责原文撰写——审阅与编辑、结果验证、项目监督、资源协调、项目管理、方法设计、资金申请、概念构思。Satinder Kaur Brar：负责原文撰写——审阅与编辑、结果验证、项目监督、资源协调、项目管理、资金申请。
未引用参考文献
2540《固体废物——水和废水检测的标准方法》，无出版日期
利益冲突声明
作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Satinder Kaur Brar表示获得了加拿大自然科学与工程研究委员会的财政支持。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会的协作研究与培训项目（编号为554777–2021）、“面向环境可持续性的应用生物技术培训项目（TABES）——探索计划”（编号分别为RGPIN-2020–06067和RGPIN-2021–03628），以及约克大学的詹姆斯与乔安妮·洛夫环境工程讲席的支持。
