利用甘油为枯草芽孢杆菌生产生物饲料原料

《Bioresource Technology Reports》：Valorization of glycerol for Bacillus subtilis bioinput production

　　利维娅·弗拉蒂切利·内维斯|安娜·卡罗莱纳·穆勒|安杰洛·加布里埃尔·克雷茨曼·罗萨|毛里西奥·托马斯·达·席尔瓦|布鲁诺·斯瓦罗夫斯基|罗热里奥·马扎尔多|瓦莱里亚诺·安东尼奥·科尔贝利尼|罗萨娜·德·卡西亚·德·索萨·施耐德|莉西亚娜·布里特斯·贝尼特斯

巴西南圣克鲁斯大学环境技术研究生项目（PPGTA），邮编96815-900，南圣克鲁斯，巴西

摘要
随着对可持续生物工艺需求的不断增加，人们越来越关注用于微生物生物质生产的替代碳源。枯草芽孢杆菌因其代谢多样性以及能够在多种底物上生长的能力，而成为一种具有生物技术价值的微生物。本研究旨在开发并评估一种简化的培养基，以纯化甘油作为生物柴油衍生甘油的替代品，同时以酵母提取物作为氮源。研究采用了因子实验设计，探讨了在12小时的浸没培养过程中，甘油浓度（2.5–7.5克/升）和酵母提取物浓度（2.0–4.0克/升）对微生物生长的影响。通过OD???值、活细胞计数（CFU毫升?1）、pH值变化以及ATR-FTIR光谱结合化学计量分析来监测微生物生长情况。结果显示，含有7.5克/升甘油和4.0克/升酵母提取物的培养条件下的微生物生物量最高，OD???值为1.42±0.03，活细胞数为8.80×10? CFU毫升?1，不过各处理组之间并未出现统计学上的显著差异（p>0.05）。所有培养基都出现了不同程度的酸化现象，pH值从7.37下降到6.46。光谱分析显示，与羟基、酰胺I/II以及羰基相关的功能团存在随时间的变化，这表明在培养过程中微生物的代谢状态发生了变化。主成分分析表明，培养基成分和培养时间会影响微生物的代谢动态，而预测模型则显示出较高的准确性（R>0.995；RMSECV<0.02）。这些研究结果支持将甘油作为可持续的碳源，并证明了ATR-FTIR结合化学计量分析方法可作为快速监测微生物培养过程的工具，有助于未来利用粗甘油进行工艺优化和规模化生产。

引言
在巴西，生物投入品在推动生物经济发展方面发挥着重要作用，它们有助于实现生物资源的可持续利用，同时也有助于开发用于农业、动物养殖、制药以及化妆品领域的生物基产品。在巴西，生物投入品还包括生物肥料、生物接种剂以及生物防治剂等生物来源的产品，这些都是构建具有抗逆性且环境友好型生产系统所必需的（Vidal等人，2021；Carvalho Vidal和Pereira Dias，2023）。随着对这些产品需求的增加，人们更加需要高效的微生物生产工艺，以便在经济和环境都可持续的条件下获得高密度的微生物生物质。

在此背景下，对农业工业废弃物的综合利用已成为推动可持续生物工艺发展的关键策略。全世界范围内产生了大量农业和工业副产品，如果处理不当，就会导致环境污染和温室气体排放（Gounina-Allouane等人，2022；Perwez和Al Asheh，2025）。小麦、水稻、燕麦、黑麦、大麦和小米等谷物副产品由于其易获取性和特定的营养成分而尤为值得关注（Sahu等人，2024）。此外，这些废弃物还富含碳元素和各种营养物质，因此非常适合用于微生物发酵过程，从而生产出酶、表面活性剂、有机酸以及微生物生物质等高附加值生物产品（Cuadrado-Osorio等人，2022；Silva等人，2025）。

包括固态发酵、浸没发酵以及综合生物精炼厂模式在内的各种废物利用策略，都被视为推动循环型生物经济和可持续生物技术发展的关键力量，有助于减轻废物处理带来的环境影响（Singh等人，2023）。在这些废弃物中，甘油作为生物柴油生产过程中的主要副产品，在酯交换反应中大量产生。虽然甘油的可用性不断增加，但它也引发了关于其处置的环境问题，同时它也为在生物技术工艺中作为替代碳源提供了可能（Chilakamarry等人，2021；Elsayed等人，2024；Teixeira等人，2026）。尽管粗甘油是一种成本低廉的优质碳源，但其成分不稳定，而且其中还含有甲醇、盐类和脂肪酸等杂质，这些都可能影响微生物的生长性能（Kumar等人，2019；Liu等人，2022；Moklis等人，2023）。因此，使用纯化甘油开展研究十分必要，这样才能为微生物创造稳定的生长条件，更深入地了解微生物的代谢反应，为后续将这一工艺应用于工业生产奠定基础。

优化培养基的组成和培养条件是发酵研究的重要课题，因为这些因素会显著影响微生物的生长和代谢产物的生成。正因如此，人们一直在寻找能够提供充足碳源和氮源的低成本替代物质。在过去十年中，农业工业废弃物的回收利用作为一种可持续策略，逐渐受到重视，它不仅有助于降低发酵成本，还能减少对环境的影响（Astudillo等人，2023；Yafetto等人，2023）。

除了作为发酵碳源之外，甘油在工业领域也有广泛的应用，例如在医学诊断和代谢紊乱检测中（Madiraju等人，2025），在药品制剂中作为糖浆的辅料（Farahnaky等人，2010），以及在化妆品、化工和食品工业中的应用（Marta V. Semkiv等人，2020；Nur Izyan Wan等人，2019；Taconi等人，2009；Yuxing Tong等人，2021）。正是这种多功能性，进一步凸显了将其纳入循环型生物经济战略中的巨大潜力。

枯草芽孢杆菌因其代谢多样性、较强的适应性以及被认定为安全物质（GRAS）的特性，而成为基于甘油进行生物工艺研究的理想微生物载体。它已被广泛用于生产酶、抗菌化合物以及其他具有生物活性的代谢产物（Schallmey等人，2004；van Dijl和Hecker，2013）。此外，枯草芽孢杆菌还具有高效吸收甘油的能力，因此很适合作为用于生产微生物生物质的培养系统的候选菌株，而这些微生物生物质可应用于生物投入品的制备（Pasotti等人，2024）。

尽管已经取得了诸多进展，但目前仍缺乏将培养基优化与实时代谢监测技术相结合的研究，以便更好地了解和控制以甘油为培养基的系统中微生物的生长动态，尤其是在用于生产生物投入品的背景下。像ATR-FTIR这样的光谱技术，结合化学计量分析方法，为监测发酵过程中的生化变化提供了一种快速且无损的替代方案，但这类技术在以甘油为培养基培养枯草芽孢杆菌中的应用仍然较为有限。

因此，本研究旨在评估甘油作为枯草芽孢杆菌浸没培养的替代碳源的可行性，重点研究培养基的优化方案，以及如何利用ATR-FTIR结合化学计量分析技术对微生物生长进行监测。虽然本研究使用了纯化甘油以确保实验结果的重复性，但这些研究结果为未来使用粗甘油开展研究以及开发用于生产生物投入品的可规模化微生物生物质生产工艺奠定了基础。

部分内容节选
微生物及接种剂准备
本研究中以枯草芽孢杆菌作为模式微生物。为了确保各次实验结果的可重复性，细菌接种剂是在标准化条件下制备的。这些微生物培养物在受控的实验室环境中培养，然后以2%（体积比）的比例加入到实验培养基中。

培养基的组成与制备
该培养基仅包含纯化甘油（纯度99%）作为碳源，以及酵母提取物作为氮源和生长因子提供者。所使用的纯化甘油来自Verquímica公司。

底物的作用
帕累托图（见图1）展示了甘油浓度（X1）、酵母提取物浓度（X2）以及二者相互作用（X1×X2）对枯草芽孢杆菌生物量生成的影响程度。在所有评估的因素中，甘油与酵母提取物之间的相互作用所产生的标准化效应最大，为0.21333，也是唯一在95%置信水平下具有统计学显著性的参数（p<0.05）。而甘油单独的作用效应和酵母提取物单独的作用效应则没有达到显著水平。

面临的挑战与未来展望
随着生物柴油生产过程中甘油的产量不断增加，人们越来越希望找到可持续的策略来利用甘油。将甘油作为微生物生物质生产的碳源，符合循环型生物经济、资源高效利用以及减少废物产生的原则。把低价值的工业副产品转化为微生物生物质，有助于构建更加一体化且可持续的生物技术体系。

结论
本研究表明，甘油与酵母提取物共同作用时，可作为一种实用且具有成本效益的培养基，用于枯草芽孢杆菌的浸没培养，以生产微生物生物质。这两种营养物质之间的相互作用显著影响了细胞的产量，在所有测试条件中，含有7.5克/升甘油和4克/升酵母提取物的培养基所培养出的微生物生物量最高，不过各处理组之间的差异并不具有统计学显著性。

作者贡献说明
利维娅·弗拉蒂切利·内维斯：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，方法学研究，实验分析。安娜·卡罗莱纳·穆勒：实验分析。安杰洛·加布里埃尔·克雷茨曼·罗萨：实验分析，概念设计。毛里西奥·托马斯·达·席尔瓦：写作——审稿与编辑。布鲁诺·斯瓦罗夫斯基：写作——审稿与编辑。罗热里奥·马扎尔多：写作——审稿与编辑。瓦莱里亚诺·安东尼奥·科尔贝利尼：写作——审稿与编辑，方法学研究。罗萨娜·德·卡西亚·德·索萨·施耐德：写作——审稿与编辑，写作——

关于写作过程中生成式人工智能及人工智能辅助技术的声明
在撰写本文时，作者使用了ChatGPT（OpenAI，GPT - 5.3版本）来协助语言润色和文本整理。在使用该工具之后，作者对所有生成的内容进行了仔细审核和修改，并对最终发表文章的内容负全责。

资金支持
本研究的部分资金来源于巴西高等教育人员发展协调委员会（CAPES）的奖学金项目——资金代码为001，项目编号为PROAP 88881853970/2023 - 1，以及巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）的资助（项目编号为306216/2022 - 1和312282/2025 - 7）。

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者们要感谢CAPES、TecnoUNISC旗下的化学与生物技术工艺及产品研究中心、巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）、南里奥格兰德州研究支持基金会（FAPERGS - 24/2551 - 0000981 - 7）以及PILZER生物技术公司。