2,193个ASS1错义变异的功能谱分析：对瓜氨酸血症Ⅰ型(citrullinemia type I, CTLN1)变异致病性及上位(epistatic)相互作用的启示

《PLOS Genetics》：Functional profiling of 2,193 ASS1 missense variants: Insights into variant pathogenicity and epistatic interactions in citrullinemia type I

　　

尿素循环基因精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthase, ASS1)的序列变异可导致常染色体隐性遗传病——Ⅰ型瓜氨酸血症(citrullinemia type I, CTLN1)。机制上，精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase, ASS)酶活性降低会损害尿素循环，引起瓜氨酸及神经毒性氨蓄积；疾病严重程度与酶功能缺陷程度相关，可表现为重症新生儿型(经典型瓜氨酸血症)至较轻晚发型。研究人员建立了人源ASS的高通量酵母(Saccharomyces cerevisiae)功能检测体系，逐个测定了代表90%所有单核苷酸变异(SNV)可及错义替换的2,193个人源ASS1氨基酸替换的功能影响。以已有临床变异注释为基准进行校验，该检测可将已知良性变异与强功能缺失(pathogenic, loss of function)变异区分开，并确定低于某功能评分阈值的变异显示具有临床相关性的ASS活性受损。应用ACMG OddsPath框架，该检测满足致病性分类PS3_supporting证据强度；当以其他灵长类动物中观察到纯合状态的变异作为良性校正对照时，可达完整PS3级别证据强度。上述结果提供直接功能学证据，有助于ASS1错义变异的重分类。按现行ACMG指南，纳入本研究数据可使所有落入功能受损区间、目前在ClinVar中被归类为意义未明变异(VUS)的25个ASS1VUS获得确定性分类(致病或可能致病)。将功能评分映射到蛋白结构证实催化残基对错义替换高度敏感；此外研究人员鉴定出ASS同源四聚体相邻亚基形成复合活性中心的残基。对这些位点进行检测揭示了一种与变异隔离(variant sequestration)模型相符的基因内互补(intragenic complementation)能力——即不同亚基的有害变异被隔离入部分活性中心而使其余无变异活性中心恢复功能，属正向上位(positive epistasis)作用的一种形式。ASS中基因内互补的发现揭示了一种新的功能互作模式，对杂合个体中变异组合的解读具临床意义。

论文解读：《Functional profiling of 2,193 ASS1 missense variants: Insights into variant pathogenicity and epistatic interactions in citrullinemia type I》，发表于《PLOS Genetics》

Ⅰ型瓜氨酸血症(citrullinemia type I, CTLN1)是由精氨琥珀酸合成酶基因(ASS1)致病变异引起的罕见常染色体隐性尿素循环障碍，因ASS酶活性不足导致血氨及瓜氨酸蓄积，可引发不可逆脑损伤甚至死亡。目前美国所有州均已将CTLN1纳入新生儿筛查推荐统一筛查面板(Recommended Uniform Screening Panel, RUSP)，初筛阳性后通常行ASS1基因测序辅助诊断。然而受限于ASS1为罕见病基因，大量检出变异缺乏足够证据而被归类为意义未明变异(variant of uncertain significance, VUS)，无法指导临床决策。功能检测可提供正交证据助力ACMG/AMP框架下的变异解读，但ASS1大规模系统性功能图谱此前未见报道。为此，研究人员建立基于芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的人源ASS错义变异高通量功能检测体系，对90%(共2,193个)单核苷酸变异(single nucleotide variant, SNV)可及的ASS1错义氨基酸替换进行功能性量化评估，旨在为ASS1 VUS提供致病性证据(PS3)，并探究ASS同源四聚体中潜在的上位(epistatic)互作模式。

主要关键技术方法：

研究人员以芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)为模式生物，构建ARG1(酵母ASS同源基因)敲除(?arg1)菌株，将人源ASS1 cDNA或其酵母密码子优化版本(yASS1)整合至ARG1启动子-终止子调控下以互补Arg1缺失表型。通过Twist Biosciences合成涵盖SNV可及错义替换的yASS1变异文库，经PCR扩增后转化入?arg1菌株，获得各含单个错义替换的酵母菌株。采用牛津纳米孔(Oxford Nanopore MinION)测序确认各菌株变异身份并质控剔除含二次突变的克隆。使用Biomek i7机器人将各克隆点种于缺精氨酸(minimal SD –Arg)固体培养基，30℃培养72 h后成像，通过PyPL8流程提取生长斑面积与灰度乘积(pseudo patch "volume")定量生长表型，以野生型yASS1(归一化为1.0)和arg1?(归一化为0)为对照进行板间/边缘/邻位效应校正，加权最小二乘回归估算各变异相对生长分数(relative growth score)。以ClinVar已知致病/良性变异及PrimateAI-3D数据库中非人灵长类纯合错义变异为基准，应用OddsPath框架评估功能评分与致病性的关联强度(PS3证据级别)。为验证基因内互补(intragenic complementation)，研究人员构建分别携带不同amorphic(功能完全缺失)错义变异的MATa/MATα haploid菌株并杂交获diploid菌株，检测复合杂合状态下的生长恢复情况。

研究结果

Establishing an in vivo ASS functional assay in yeast（建立酵母体内ASS功能检测体系）

研究人员将人源ASS1(hASS1)及密码子优化版(yASS1)整合至酵母ARG1位点，证实hASS1可互补arg1?但生长仅为野生酵母ARG1的73%，yASS1优化后达98%；已知ClinVar致病错义变异(p.Arg157His、p.Ser180Asn)生长接近0%，已知良性变异(p.Thr208Ala、p.Glu256Lys)生长约97%～98%野生型水平，证明该系统可区分ASS功能受损与完好状态，后续全库检测均采用yASS1背景。

Comprehensive analysis of the functional impact of SNV-accessible amino acid substitutions in ASS（ASS所有SNV可及错义替换功能影响的全面分析）

对2,193个独特ASS1错义替换进行相对生长定量检测(r2=0.947重复性好)，按双峰分布定义：amorphic(生长<0.05，n=224)、hypomorphic(0.05–0.85，n=323)、functionally unimpaired(>0.85，n=1,646)；该分类仅反映体外功能活性，不直接等同于临床致病/良性。

Bimodal distribution of assay results identifies a large class of variants with severe loss of ASS function（检测结果的双峰分布识别出一大类严重丧失ASS功能的变异）

归一化生长分数呈明显双峰，以生长<0.05和>0.85为界划分三类功能等级，224个变体属严重功能缺失(amorphic)，323个部分受损(hypomorphic)，1,646个功能未受损，证实ASS错义变异对功能影响呈两极分化特征。

Assay results are consistent with evolutionary conservation and functionally important structural features（检测结果与进化保守性及功能重要结构特征相符）

73.2%的amorphic变异发生在ConSurf保守残基(显著多于unimpaired组之50.1%, p=5.0×10?11)。底物结合残基(瓜氨酸结合：Tyr87、Asn123、Arg127、Ser189、Glu191、Glu270、Tyr282；天冬氨酸结合：Thr119、Asn123、Asp124)及推断ATP结合残基(P-loop中Ser12、Gly14、Asp16、Thr17及Arg95、Gly117、Thr119、Asp124、Ser180、Asp182等)对错义替换极敏感，90.7%及83.0%之相应变异生长<0.85，其中分别61.1%和61.4%为amorphic，与文献酶活检测一致。此外鉴定到29个≥50%变体为amorphic的敏感残基，多数位于活性口袋或参与四聚化(如Phe333、Cys337、Arg363、Arg398)。

Functional assay provides PS3_supporting level evidence towards pathogenicity for ASS1 variants（功能检测为ASS1变异致病性提供ACMG PS3_supporting级别证据）

以ClinVar标注(56个致病/疑似致病、4个良性)校准，生长<85%区间OddsPath=2.43达PS3_supporting；547个生长<85%之氨基酸替换可提供此级别人士致病证据，使25个落入此区间之ClinVar VUS中11个升为Likely Pathogenic。以PrimateAI-3D中非人灵长类纯合错义变异(n=41，全部生长>85%)作良性代理校准，OddsPath升至27.32，达完整PS3强度，可使19个原VUS(生长<85%)全部重分类为Pathogenic/Likely Pathogenic。56个ClinVar致病错义变异中22个生长≥85%，多位于二聚化界面或关联晚发轻型，因此生长>85%不用于支持良性判定。

Regions from two subunits contribute to each ASS active site which allows intragenic complementation to occur（ASS各活性中心由两个亚基区域共同构成从而使基因内互补得以发生）

结构分析示ASS延伸环(residues 375–378)紧邻相邻单体活性口袋口(Gly156、Arg157亦为高敏感残基)。研究人员构建各带amorphic变异之单倍体菌株杂交发现：两个活性口袋内amorphic变异间、或两个延伸环amorphic变异间组合无恢复；但一个活性口袋amorphic变异与一个延伸环amorphic变异(如Met377Ile × Arg157His等)之复合杂合diploid菌株显著恢复ASS功能，首次在ASS1证实基因内互补(intragenic complementation)，符合Crick-Orgel变异隔离模型，表明ASS活性中心为跨亚基复合活性位点(compound active site)。

讨论与结论总结：

研究人员指出本酵母功能检测覆盖90% SNV可及ASS1错义变异，界定生长<85%为功能受损阈值(对应野生型峰左缘)，ClinVar基准下达PS3_supporting，引入灵长类纯合错义变异作良性参照可达PS3级，可有效解决ASS1 VUS解读瓶颈，使ClinVar中落入功能受损区之25个VUS获确定分类、其中全部19个原VUS可升为致病/可能致病。因部分二聚化界面致病变异在酵母中生长近野生型，生长>85%不作为良性证据，解读需谨慎。此外首次发现ASS具跨亚基复合活性中心及基因内互补现象，警示常染色体隐性病复合杂合状态需考量非加性(epistatic)等位基因互作对表型的影响。结论：本研究建立之高通量ASS1错义变异功能图谱为CTLN1分子诊断及VUS重分类提供直接功能证据，并揭示ASS同源四聚体中基因内互补新模式，支持将功能及组合效应数据整合入CTLN1诊断流程。