少突胶质前体细胞中自发与诱发的钙反应的机制：一项模型化研究

《PLOS Computational Biology》：Mechanisms underlying spontaneous and evoked calcium responses in oligodendrocyte precursor cells: A modeling investigation

　　

摘要：钙(Ca²⁺)信号已成为少突胶质细胞中活性依赖性髓鞘形成的中心调节因子。这些Ca²⁺信号包括不依赖于刺激的自发钙局部瞬变(SCaLTs)，这些瞬变以电压非依赖性方式内在产生或由膜电压促进，以及由三磷酸腺苷(ATP)和谷氨酸释放触发的诱发反应。为了研究这种复合尖峰活动背后的调节机制，研究人员开发了一个少突胶质前体细胞(OPCs)中Ca²⁺瞬变的随机时空通量平衡模型。该模型整合了这些细胞中所有相关通量，并利用拟合至Ca²⁺荧光记录的参数，将膜电压动力学与钙诱导钙释放(CICR)机制相结合。该模型在缺乏嘌呤能和谷氨酸能受体的情况下重现了OPCs中的内在和电压促进的SCaLTs，并捕获了由长时间ATP和谷氨酸刺激诱发的三种不同模式的Ca²⁺反应（通过机器学习分类器识别）。该模型强调了ATP和谷氨酸在产生这些簇中的作用，并表明CICR的快速动力学是产生这些诱发反应的关键。对模型的进一步分析还揭示，电压门控L型和T型Ca²⁺通道略微增加SCaLTs的频率，而使用模拟体内条件的随机分布脉冲进行ATP和谷氨酸刺激，导致Ca²⁺尖峰（即SCaLTs与诱发反应的组合）振幅以及宽尖峰出现频率的增加，尤其是谷氨酸刺激下。对模型确定性版本（无扩散）的分岔分析表明，ATP和谷氨酸刺激可将系统转变为振荡状态，从而增加SCaLT动力学的确定性成分。因此，本研究提供了OPC Ca²⁺瞬变的全面表征，将体外记录的行为与体内动力学联系起来。

少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells, OPCs）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的一类干细胞，其分化为少突胶质细胞后形成髓鞘，髓鞘包裹轴突并支持跳跃式传导，显著提高神经信号传递的速度和效率。钙（Ca²⁺）信号已被确认为活性依赖性髓鞘形成的核心调节因子。这些Ca²⁺信号包括两种类型：一是不依赖于刺激的自发Ca²⁺局部瞬变（spontaneous Ca²⁺ local transients, SCaLTs），其以电压非依赖性方式内在产生或由膜电压促进；二是由ATP和谷氨酸释放触发的诱发反应。已有研究表明，OPCs表达多种Ca²⁺通量机制，包括储存操纵的Ca²⁺内流（store-operated Ca²⁺ entry, SOCE）、钠钙交换器（sodium/calcium exchanger, NCX）、钙诱导钙释放（Ca²⁺-induced Ca²⁺-release, CICR）以及电压门控Ca²⁺通道（voltage-gated Ca²⁺ channels, VGCCs），同时表达嘌呤能P2X7受体（P2X7Rs）和谷氨酸能AMPA及NMDA受体（AMPARs和NMDARs）。然而，膜电压波动和VGCCs如何影响SCaLTs，以及嘌呤能和谷氨酸能受体与膜去极化在塑造诱发Ca²⁺反应中的相互作用，仍不清楚。为解决这些问题，研究人员开展本研究，旨在通过计算模型解析OPCs中自发与诱发Ca²⁺瞬变的机制，连接体外实验与体内动力学。

研究人员进行了以下研究：在前期开发的随机时空通量平衡模型（stochastic spatiotemporal flux-balance model, SSM）基础上，扩展其维度，纳入膜电压动力学（使用Hodgkin-Huxley形式化描述）、L型和T型电压门控Ca²⁺通道、P2X7R、AMPAR和NMDAR的动力学，并追踪Na⁺和K⁺浓度变化。模型参数通过拟合来自原代培养的小鼠皮层OPCs的Ca²⁺荧光记录数据确定。研究人员利用该模型重现了OPCs中的SCaLTs和由ATP/谷氨酸长时间刺激诱发的三种不同模式Ca²⁺反应（通过k-means聚类识别），并通过分岔分析和随机刺激模拟揭示其动力学机制。该研究发表在《PLOS Computational Biology》上。研究结论表明：VGCCs略微增加SCaLT频率；CICR（尤其是通过Ryanodine受体，RyR）的快速动力学是产生诱发反应的关键；ATP和谷氨酸刺激可将系统驱入振荡状态，增加SCaLT的确定性成分；模拟体内条件的随机脉冲刺激下，Ca²⁺尖峰振幅增大且宽尖峰比例增加，其中谷氨酸效果更显著。该研究提供了一个连接体外记录与体内动力学的OPC Ca²⁺瞬变综合表征框架，对理解活性依赖性髓鞘形成具有重要意义。

本研究用到的主要关键技术方法包括：随机时空通量平衡模型（SSM）及其确定性简化版本（deterministic temporal model, DTM），整合了Hodgkin-Huxley膜电压方程、L型和T型Ca²⁺通道动力学（采用稳态激活/失活曲线）、P2X7R（四态马尔可夫模型）、AMPAR（三态模型）和NMDAR（三态模型）的受体动力学、IP₃R的Li-Rinzel模型和RyR的Levine-Keizer模型用于CICR、SOCE和NCX通量、SERCA和PMCA泵、扩散方程（一维空间，长度8 μm）。通过Ornstein-Uhlenbeck噪声过程模拟IP₃R的随机聚类动力学。使用分岔分析（XPPAUT中的延续方法）研究[ATP]和[Glut]对系统行为的影响。采用k-means聚类分析实验和模拟Ca²⁺反应模式。原代细胞来源为出生后1天小鼠的大脑皮层，经机械分离和纯化培养获得纯度>98%的OPCs。

**3.1 诱发反应的分岔分析**
通过构建DTM并去除扩散和噪声，研究人员进行了以ATP浓度([ATP])和谷氨酸浓度([Glut])为参数的分岔分析。结果显示，对于[ATP]，膜电压(V)和胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)在低、中、高浓度下呈现三个不同行为区：低和高[ATP]为稳定平衡分支（静息态），中等[ATP]区间出现Hopf分岔(HB)和环面分岔(TR)，产生振荡（不规则尖峰）。对于[Glut]，在低浓度下为静息态（III类可兴奋性，可产生SCaLTs），中等浓度出现混合模式振荡（经Hopf分岔和环面分岔），高浓度出现紧张性尖峰振荡（经倍周期分岔和同宿分岔）。这表明ATP和谷氨酸刺激均可驱动系统进入周期性Ca²⁺尖峰状态，从而解释诱发反应。

**3.2 L型和T型Ca²⁺通道对SCaLTs的影响**
在SSM中纳入L型和T型Ca²⁺通道后，时空模拟显示出现短暂传播的Ca²⁺波。与不含这些通道的KO条件相比，WT（含VGCCs）条件下Ca²⁺尖峰数量显著增加（分布尾部延长），尖峰振幅增加，但阈下振荡不受影响。这表明VGCCs通过促进Ca²⁺内流进一步增强了SCaLTs。

**3.3 ATP诱导的OPC Ca²⁺反应**
实验中对OPCs施加100 mM ATP长时间刺激（60 s开始），记录到99个ROIs的Ca²⁺信号，经聚类分为三个不同组：陡峭上升组、平缓上升组和下降组。利用SSM模拟不同浓度ATP刺激（100、55、43 mM），发现高浓度[ATP]=100 μM再现陡峭上升组，较低浓度分别匹配平缓上升和下降组。结果表明P2X7R介导ATP诱发反应，且不同细胞经历的[ATP]可能不同，随机性在塑造反应中起关键作用。

**3.4 谷氨酸诱导的OPC Ca²⁺反应**
类似地，对OPCs施加100 mM谷氨酸长时间刺激，记录100个ROIs的信号聚类为三种模式。SSM模拟显示[Glut]=100 μM准确再现陡峭上升组，降低至60和40 μM分别匹配平缓和下降组。结果表明AMPAR和NMDAR介导谷氨酸诱发反应，随机性再次被强调。

**3.5 RyR在ATP和谷氨酸依赖性Ca²⁺反应中的作用**
通过阻断CICR（抑制IP₃R和RyR）模拟，发现ATP和谷氨酸诱发反应的双相特征（快速上升后缓慢上升）完全消失，仅留下缓慢上升。分别阻断RyR或IP₃R显示，RyR敲除导致双相消失，而IP₃R敲除后双相保留但SCaLTs消失。这表明RyR的快速CICR动力学是产生典型诱发反应的关键，而IP₃R主要负责SCaLTs的随机波动。实验结果提示Hanks' Balanced Salt Solution可能通过阻断IP₃R来抑制SCaLTs。

**3.6 模拟体内条件的ATP和谷氨酸刺激下的Ca²⁺反应**
使用随机分布脉冲（低、中、高频率，持续0.1 s）模拟体内条件，分别施加ATP和谷氨酸刺激。结果发现：两种刺激均增加Ca²⁺尖峰振幅和宽尖峰比例，其中谷氨酸效果更显著（在中高频率下更明显）。通量分析显示，CICR通量（通过IP₃R和RyR）显著增加，SOCE相应增加以防止内质网耗竭，而VGCC通量变化不大。膜电压在高频刺激时出现轻微超极化。这些结果表明，体内样随机刺激可诱导宽Ca²⁺尖峰，可能影响OPC功能及其向少突胶质细胞的分化。

**讨论部分总结**：
研究人员讨论了模型扩展的意义：纳入VGCCs后增强了SCaLTs的频率，可能有助于将Ca²⁺尖峰频率调节至促进髓鞘形成的“金发姑娘区”。分岔分析表明ATP和谷氨酸刺激可将系统从随机SCaLTs转向确定性振荡，稳定Ca²⁺信号。P2X7R的I1（快速）和I2（慢速）电流成分通过CICR放大形成诱发反应的双相特征，而RyR而非IP₃R是CICR中提供协同的关键。随机刺激模拟显示，即使短暂弱输入也能通过可兴奋系统驱动状态转换，产生宽尖峰，这对细胞分化和髓鞘形成有潜在影响。研究还指出，Hanks' Balanced Salt Solution可能通过抑制IP₃R减少随机波动，该假说有待实验验证。最后，研究人员认为该模型提供了连接体外和体内Ca²⁺动力学的框架，为理解神经-少突胶质细胞相互作用及髓鞘相关过程奠定了基础。

**研究结论原文翻译**：因此，本研究提供了OPC Ca²⁺瞬变的全面表征，将体外记录的行为与体内动力学联系起来。