C1/C5双底物策略提升甲基营养型酵母*Komagataella phaffii*（*Pichia pastoris*）的单细胞蛋白产量

《Green Carbon》：C1/C5 bi-substrate strategy boosts single-cell protein production in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris)

　　

木质纤维素生物质以及最近出现的C1资源（如甲醇），因其不与粮食竞争、广泛可用且成本低，已成为可持续生物制造的有前景的替代原料。然而，高效利用源自木质纤维素生物质的戊糖（C5）和甲醇（C1）仍然具有挑战性，因为它们的同化速率和转化率显著低于传统的葡萄糖基生物转化。C1和C5底物代谢共享一个共同的碳重排网络（CRN），这为将它们共利用作为应对这些挑战的潜在策略提供了生物学基础。利用广泛应用的甲基营养型酵母*Komagataella phaffii*（*Pichia pastoris*），研究人员证明，与单独使用木糖或甲醇培养相比，甲醇/木糖双底物策略显著提升了单细胞蛋白的产量。通过系统生物学方法，研究人员揭示，在双底物条件下，甲醇通过激活过氧化物酶体CRN促进了木糖的同化，而木糖则通过最小化异化途径的碳损失并提高能量效率，提升了从甲醇获得的生物质产量。这些结果确立了C1/C5双底物策略作为一种有效方案的可行性和机制基础，用于克服利用C1和C5碳资源作为生物制造替代原料时固有的限制。

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#### 研究背景与问题

在生物制造领域，选择合适且可持续的原料至关重要。尽管源自淀粉类作物（如玉米）的葡萄糖被广泛用作高效碳源，但其生产严重依赖耕地，并与粮食供应直接竞争，引发了可持续性问题。为解决这些挑战，木质纤维素生物质以及近来兴起的C1资源（如甲醇）被积极探索作为替代原料。木质纤维素生物质主要来源于农业残留物、林业副产品和能源作物，含有高比例的戊糖（C5，主要是木糖），但微生物细胞工厂对木糖的有效同化仍是一大难题。同时，绿色甲醇可通过可再生能源（如太阳能、风能）从二氧化碳低成本生产，是一种有前景的单细胞蛋白（SCP）、酶和化学品生产的下一代原料。然而，甲醇的生物转化仍处于早期阶段，存在碳收率低和C1利用效率低等问题。

值得注意的是，甲醇（C1）和木糖（C5）的代谢共享一个共同的碳重排网络（CRN）。甲醇通过核酮糖单磷酸途径（RuMP）和木酮糖单磷酸途径（XuMP）同化，涉及甲醛（C1）与戊糖-5-磷酸（C5-P）的反应，高效的甲醇同化依赖于活性CRN来再生C5-P中间体。木糖同化则从木糖转化为C5-P开始，随后进入CRN。这种对CRN的共同依赖暗示了两种底物代谢的互补性。研究人员假设，C1和C5底物的共利用可能产生协同效应，提升生物质产量。例如，具有高效甲醇同化CRN的天然甲基营养菌若通过代谢工程引入高效木糖-to-C5-P途径，可能也能有效利用木糖。C5与C1的共利用可直接提供C5-P中间体，绕过复杂的碳重排步骤，从而提升甲醇同化效率。

因此，本研究的目的是通过构建基于*Komagataella phaffii*（*Pichia pastoris*）的细胞工厂，验证C1/C5双底物策略能否克服单一底物利用的限制，并解析其机制。该研究发表在《Green Carbon》期刊上。

#### 关键技术与方法

本研究主要采用了以下关键方法：1. **代谢工程与菌株构建**：将异源木糖异构酶（XI）基因转入*K. phaffii* GS115菌株，构建了木糖同化增强的工程菌株GS-XI。2. **发酵培养**：在摇瓶中进行不同比例甲醇/木糖的批次培养，监测细胞生长、底物消耗和生物质产量。3. **¹³C代谢通量分析（¹³C-MFA）**：使用¹³C标记甲醇与未标记木糖的混合物培养细胞，基于蛋白源氨基酸的标记模式，通过高质量的分室化代谢网络模型（包含细胞质、线粒体和过氧化物酶体）计算胞内代谢通量。4. **蛋白质组学分析**：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对不同碳源条件下细胞的全蛋白质组进行定量比较，验证通量分析结果并揭示蛋白质水平的变化。

#### 研究结果

**3.1 亲本*K. phaffii*菌株在C1/C5双底物上的生长**：在基本盐培养基（BSM）中，亲本菌株在单一木糖（20 g/L）上的平均比生长速率（0.0173 h^-1）显著低于甲醇（0.0401 h^-1）。使用甲醇/木糖（各10 g/L）双底物时，最终生物量比单独甲醇高16.3%，生物质碳收率提升13.5%。但木糖对甲醇利用存在轻微抑制作用。

**3.2 工程改造的木糖同化*K. phaffii*在甲醇/木糖双底物上呈现增强的生长**：通过导入异源木糖异构酶构建的GS-XI菌株在单一木糖上的比生长速率（0.050 h^-1）与甲醇（0.056 h^-1）相近。在20%甲醇/80%木糖条件下，最终生物量比单独甲醇高41%，比单独木糖高65%，且木糖同化量增加3.4倍，总碳消耗增加4.8倍。增强的生长主要由木糖和总碳吸收增加驱动，且生物质收率随木糖比例升高而增加。

**3.3 甲醇通过激活过氧化物酶体CRN加速木糖同化**：形态学分析显示甲醇诱导过氧化物酶体形成，而纯木糖条件下则无。蛋白质组学比较发现，与纯木糖相比，甲醇/木糖条件下甲醇代谢关键酶（如醇氧化酶AOX）和过氧化物酶体CRN酶（如RPI、FBA2）显著上调，而细胞质戊糖磷酸途径的转醛醇酶（TAL）和转酮醇酶（TKL）下调。这表明，甲醇诱导的过氧化物酶体增殖提升了局部CRN酶浓度，木糖衍生的木酮糖-5-磷酸（Xu5P）进入过氧化物酶体后高效转化为甘油醛-3-磷酸（GAP）并穿梭回细胞质，从而显著增强木糖代谢效率。

**3.4 木糖通过减少C1异化和提升能量效率改善甲醇的碳收率**

**3.4.1 基于高质量分室化¹³C代谢通量分析的甲醇/木糖通量分布研究**：研究人员构建了包含过氧化物酶体和线粒体的分室化¹³C-MFA模型，模拟了不同甲醇/木糖比例下的通量分布。结果显示，随着木糖比例增加，甲醇代谢通量下降，同时甲醇流向异化途径的比例从56.3%显著降至31.2%，表明碳同化效率提高，碳损失减少。过氧化物酶体XuMP循环通量下降，说明细胞更多依赖木糖提供Xu5P。同时，中心代谢途径（如糖异生、戊糖磷酸途径、TCA循环）通量增加，葡萄糖-6-磷酸积累为核苷酸合成提供前体，TCA循环通量增加贡献了更多的NADH。

**3.4.2 通过¹³C-MFA分析甲醇/木糖比例对能量和NAD(P)H生产的影响**：通量分析表明，随木糖比例增加，NADPH产量增加（通过氧化性PPP），为生物合成提供还原力。然而，总NADH产量反而下降，因为甲醇异化途径产生的NADH大幅减少，而中心代谢途径产生的NADH增加，但不足以抵消。这说明高甲醇比例下产生过量NADH，部分碳以CO₂形式浪费。ATP产量与细胞生长正相关，但高甲醇条件下仅有约1/3 ATP来自氧化磷酸化，表明NADH向ATP的转化效率低（P/O比低），这可能由于细胞质NADH向线粒体穿梭存在瓶颈。因此，木糖共利用通过减少异化途径的无效循环，实现了更高效的NADH与ATP耦联，从而提升生物质收率。

**3.4.3 蛋白质组学分析揭示与模型模拟一致的蛋白质组重新分配**：蛋白质组学比较了不同甲醇/木糖比例下的蛋白表达，结果与¹³C-MFA一致：随木糖比例增加，甲醇代谢相关蛋白（XuMP循环酶、甲醛氧化酶）下调，而木糖同化途径和中心代谢途径（糖酵解、PPP、TCA循环、乙醛酸循环）的酶上调。这验证了分室化模型预测的准确性。

#### 总结与讨论

本研究成功验证了C1/C5（甲醇/木糖）双底物策略在提高单细胞蛋白产量方面的可行性与机制基础。关键发现是：甲醇通过诱导过氧化物酶体CRN激活，显著加速了木糖的同化；而木糖通过抑制甲醇的异化途径（即碳损失）并提升能量效率，从而提高了甲醇的碳收率。这种协同效应使得双底物策略优于单一底物。

讨论部分指出，尽管木糖是较弱的阻遏碳源，但高浓度下仍通过经典的碳代谢物阻遏（CCR）机制显著抑制甲醇利用途径（XuMP下调），可通过敲除CCR调节因子或过表达激活因子来缓解。此外，通过增加木糖异构酶基因拷贝数或增强木糖转运，可进一步提升双底物策略的效果。该策略在工业规模下可能降低CO₂排放和操作能耗（如减少通气与冷却需求）。

**研究结论**：利用具有广泛工业应用的甲基营养型酵母*K. phaffii*，研究人员证明了C1/C5双底物方法是一种有前景的策略，可克服将其用作生物转化原料的挑战。C1/C5共利用策略提升了木糖的同化速率和甲醇的碳收率，从而显著改善了与单一底物条件相比的细胞生长。此外，通过形态学分析和系统生物学工具（如分室化¹³C-MFA和蛋白质组学），研究人员揭示了木糖同化增强源于甲醇诱导的过氧化物酶体CRN激活，进而提升了碳重排能力；而甲醇上细胞生长增强则归因于木糖共投喂带来的最小化C1异化和能量效率提升。这些见解为C1/C5双底物方法作为解决其限制的有效策略建立了机制基础，从而为利用木质纤维素生物质或C1资源作为生物制造的替代底物提供了有价值的参考。