具有增强过氧化酶活性的NiSe/rGO纳米酶用于半定量检测半胱氨酸：实验研究与分子对接分析

《Inorganic Chemistry Communications》：NiSe/rGO nanozyme with enhanced peroxidase-like activity for colorimetric detection of cysteine: experimental and molecular docking insights

　　

Saumya Maurya|Priyanka Jha|Himanshu Payal|Ashish Chalana

印度北方邦大诺伊达，沙尔达大学沙尔达工程与科学学院化学与生物化学系，邮编201310

摘要

采用一步水热法合成了NiSe/rGO纳米杂化材料，并对其增强的过氧化物酶样活性以及用于半定量检测半胱氨酸的能力进行了深入研究。通过结构与形态分析（FE-SEM和TEM）证实，NiSe纳米颗粒在rGO纳米片表面均匀生长且分布均匀，这增强了界面相互作用并加快了电子传输速度。在过氧化氢存在下，该纳米杂化材料对3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）等显色底物的氧化反应表现出比纯NiSe更好的催化性能。由于NiSe与rGO之间存在强相互作用，Michaelis–Menten动力学分析显示其K_m值更低，V_max值更高，这说明该材料对底物的亲和力更强，催化效率也更高。以对苯二甲酸作为荧光指示剂，机理分析表明，由羟基自由基（•OH）介导的底物氧化反应中，关键活性物种的形成因纳米杂化材料中的有效电子转移而显著增强。通过分子对接等计算实验进一步分析发现，NiSe/rGO的结合亲和力高于纯NiSe，这体现了其在分子层面的更强催化活性。该NiSe/rGO纳米酶展现出出色的催化潜力，可用来以约1.73?μM的优异检测限实现半胱氨酸的半定量检测。此外，该检测方法在存在多种可能干扰的氨基酸和生物分子（包括谷胱甘肽）的情况下仍能保持良好的选择性。通过实际样品分析进一步验证了该传感平台的实用性，其回收率在96%到99%之间。

引言

天然酶和植物源酶属于高效且具有高底物选择性的可持续生物催化剂。然而，它们容易发生结构不稳定，甚至会在暴露于电离辐射时变性[1]、[2]。一般来说，酶在X射线和γ射线照射下会发生结构变化，因为水的分解会产生活性氧，这些活性氧会攻击氨基酸残基，使酶失去活性[3]、[4]。尽管酶放大法和等温放大法能够提供极高的分析灵敏度，但由于酶稳定性差、操作步骤繁琐以及信号转导系统复杂，这些方法的实际应用受到限制[5]、[6]。类似地，具有表面增强拉曼散射活性的金属及金属有机纳米材料虽可实现超灵敏检测，但通常需要昂贵的仪器和复杂的谱图分析，这限制了它们在便携式即时检测中的应用[7]、[8]。相比之下，人工纳米酶是一种坚固、成本低廉且可高度调控的纳米材料，它们具备过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等类似酶的活性，因此非常适合用于生物传感、环境修复以及肿瘤催化等领域[1]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。

基于过渡金属的纳米酶，如镍基纳米颗粒，具有类似辣根过氧化物酶的活性，而且人们已经开发出了许多具有良好催化效率和稳定性的纳米材料。例如，NiSe由于其导电的Ni²⁺/Ni³⁺氧化还原耦合机制而具备类似酶的过氧化物酶活性，此外还有纳米酶[1]、[14]、[15]、[16]；Fe/N共掺杂的图迪yne[17]以及基于金属的复合材料（如NC/Fe₃O₄/Ag[18]、NiFe-LDH[19]）通过配体修饰和分子印迹聚合物处理，显著提升了其过氧化物酶模拟性能和稳定性，进而提高了催化效率并增强了底物选择性[20]。将NiSe与rGO结合使用，可以克服传统材料的局限性，因为这种组合既能提供活性位点，又具有高导电性，同时还存在的结构缺陷有助于促进H₂O₂的活化、电子传输以及活性位点的稳定性[21]。虽然已有多种酶类系统被研究，但NiSe/rGO系统更具优势，因为其中的NiSe含有多个可参与氧化还原反应的Ni²⁺/Ni³⁺活性中心，能够实现高效的过氧化物酶样活性，而rGO作为载体则有助于快速电子传输，同时还能抑制纳米颗粒的聚集。此外，NiSe在rGO表面的原位生长形成了强大的界面耦合，从而产生了大量活性位点，这有利于在温和反应条件下提升催化效率和传感性能。除了催化作用外，纳米酶在敏感检测生物分子方面也展现出巨大潜力。半胱氨酸是一种含硫氨基酸，可通过纳米颗粒聚集反应进行量热检测，其检测限可低至5–10?nM[1]、[22]、[23]。半胱氨酸水平异常与多种疾病相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病以及肝脏功能异常等。目前已有多种基于纳米颗粒的半胱氨酸检测方法被开发出来。例如，Baoxin Li描述了一种利用Cu²⁺促进金纳米颗粒聚集的方法，其最低检测限可达10?nM，且具有优异的选择性[22]、[24]；Zaryabi等人则利用柠檬酸包覆的银纳米颗粒，通过银-硫介导的聚集反应实现了快速检测，其检测限约为5.1?nM[25]；Verucchi等人则利用磁性的Fe₃O₄/S、N-GQD–AuNP纳米传感器实现了血清和尿液中半胱氨酸的超灵敏检测[26]。此外，Mirkin等人还报道了基于金属离子介导的聚集-解聚过程的金纳米颗粒/金核壳纳米结构[22]、[27]、[28]；不过也有不少基于rGO的金属硒化物纳米酶被用于半定量检测。本研究的优势在于，由于NiSe在导电的rGO表面原位生长，因此形成了强大的界面耦合并提升了电子传输效率。NiSe与rGO之间的协同作用不仅提高了该纳米杂化材料对TMB-H₂O₂体系的催化效率，还增强了其对半胱氨酸分子的亲和力，从而能够在温和条件下实现高效、选择性的半胱氨酸检测，且检测结果具有更好的稳定性和重复性。尽管已有不少基于rGO的金属硒化物纳米酶被用于催化和传感应用，但NiSe/rGO纳米杂化材料在半胱氨酸检测方面的过氧化物酶样行为尚未被研究过。此外，分子对接研究也表明，NiSe/rGO与过氧化物酶相关蛋白靶标的结合亲和力高于纯NiSe，这为该材料更强的催化活性提供了理论支撑。鉴于其良好的操作稳定性和热稳定性，NiSe/rGO纳米酶是一种极具潜力的高效半定量传感平台。

在本研究中，我们以(CH₃COO)₂Ni·4H₂O、硒粉和氧化石墨烯为原料，通过水热合成法实现了NiSe/rGO纳米杂化材料的原位制备。与纯NiSe纳米颗粒相比，这种新合成的纳米杂化材料表现出显著更高的过氧化物酶样活性。它能有效催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺和邻苯二胺的氧化反应，分别产生强烈的蓝色和黄色显色信号。此外，我们还利用NiSe/rGO在显色检测方面的优势，开发出一种用于半胱氨酸检测的传感器。光致发光测量和自由基捕获实验表明，羟基自由基（•OH）和超氧自由基（O₂^●-）分别是催化TMB和OPD氧化反应的主要和次要反应物，而NiSe/rGO的协同界面大大增强了这些自由基的形成速率。分子对接研究也显示，与纯NiSe相比，NiSe/rGO纳米杂化材料与生物分子模型的结合亲和力显著更强，这一结果进一步支持了实验观察结果。据我们所知，这项研究首次展示了利用NiSe/rGO纳米杂化材料的酶模拟特性来实现半胱氨酸的显色检测。此外，该研究还有助于实现可持续发展目标中的健康保障和清洁水目标[29]、[30]，因为它提供了一种高效、可持续的纳米酶平台，可用于健康监测和环境监测。

章节节选

材料与方法

本研究所使用的所有试剂均为分析级，无需额外纯化。Sigma-Aldrich公司提供了3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、邻苯二胺、对苯二甲酸、四水合醋酸镍（CH₃COO)₂Ni·4H₂O）、硒粉、油胺、半胱氨酸、叔丁醇以及苯醌。石墨粉、高锰酸钾、硫酸、磷酸、人工尿液以及过氧化氢则从其他商家购买。

NiSe/rGO纳米杂化材料的合成与表征

在水热合成NiSe/rGO纳米杂化材料时，使用了还原氧化石墨烯、四水合醋酸镍以及硒粉作为前驱体。氧化石墨烯是通过改良的Hummer法制备的[36]。图1展示了NiSe/rGO的材料合成流程。在水热反应过程中，氧化石墨烯会被同时还原为还原氧化石墨烯，它既可作为导电载体，也可作为纳米颗粒生长的核基质。

结论

总之，通过一步水热原位合成法成功制备出了NiSe/rGO纳米杂化材料，该方法避免了纳米颗粒的聚集，使得NiSe纳米颗粒在rGO表面均匀分布。通过TEM和FE-SEM进行的结构分析证实了NiSe在rGO表面的分散状态。从对TMB的优异氧化效果可以看出，该纳米杂化材料具有出色的过氧化物酶样活性，其催化效率甚至超过了纯NiSe。此外，NiSe/rGO还表现出更高的V_max值。

作者贡献

本论文是由所有作者共同完成的。所有作者均已审阅并同意最终版本的内容。

CRediT作者贡献说明

Saumya Maurya：撰写原始稿件、数据可视化、结果验证、软件应用、方法设计、实验研究、数据整理。 Priyanka Jha：撰写原始稿件、数据可视化、结果验证、软件应用、方法设计、实验研究、数据整理。 Himanshu Payal：参与稿件审阅与编辑工作、负责项目指导。 Ashish Chalana：参与稿件审阅与编辑工作、撰写原始稿件、数据可视化、结果验证、实验研究、概念设计。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢美国德克萨斯州大学城分校生物医学工程系的Sayantan Tripathy博士，他在生物样本处理方面给予了宝贵的建议和指导。

Saumya Maurya是印度沙尔达大学SSES化学与生物化学系的博士研究生。她拥有印度沙尔达大学的化学硕士学位。她的研究方向主要是合成基于硒的纳米材料，并将其作为过氧化物酶模拟纳米酶应用于生物医学领域。她的研究兴趣包括纳米酶、纳米材料、生物传感器、催化作用、密度泛函理论模拟、分子对接研究以及基于ORCA的量子化学计算等。