基于快速傅里叶变换方波伏安法与分子对接验证的新型无标记电化学适体传感器用于H9N2流感早期检测

《International Journal of Climate Change Strategies and Management》：A novel label-free EC aptasensor for early detection of H9N2 influenza using FFT-square wave voltammetry and validated by molecular docking

　　

H9N2禽流感病毒（AIV）威胁全球禽类生产及人类健康，其可通过跨种传播并作为新兴流感毒株的基因储备库，凸显了快速可靠早期检测的必要性。研究人员报道了一种基于B4抗H9N2血凝素（HA）适体的无标记电化学（EC）适体传感器，该适体首次作为生物识别元件应用于电化学传感平台。与常规抗体系统相比，B4适体具有高结合亲和力、改善的结构稳定性以及识别完整病毒颗粒的能力，可实现可靠的无标记检测。计算建模（包括分子对接和分子动力学（MD）模拟）被用于评估适体-靶标相互作用，并针对结构相关病毒靶标筛选候选序列，达到约90–95%的预测特异性。该方法支持合理的适体选择并减少实验试错。传感界面整合氧化铈纳米颗粒（CeO₂)、电化学还原氧化石墨烯（rGO）和电沉积金纳米颗粒（AuNPs），形成导电稳定的纳米结构平台。PolyA–PolyT修饰适体通过腺嘌呤-金亲和作用实现无巯基、定向控制的固定化，改善靶标可及性并减少空间位阻，同时CeO₂增强生物分子吸附和固定化稳定性。信号转导采用快速傅里叶变换方波伏安法（FFT-SWV）在简化的微型化恒电位仪架构中进行，部分信号滤波从硬件转移至软件。该方法在频域中抑制电容背景和噪声，提高信噪比并实现更低检测限，同时支持便携式实施。在优化条件下，适体传感器在1.0 × 10¹至1.0 × 10⁵ PFU mL^?1范围内呈线性响应，检测限为0.25 PFU mL^?1（R² ≈ 0.99）。该传感器表现出高选择性、优异重现性（RSD < 4%）及十天稳定性能，在尿囊液中保持性能，证实了复杂生物傣矩阵中的鲁棒性。该工作提出了一种灵敏且模块化的电化学传感平台，整合计算指导的适体设计、工程化纳米界面和先进信号处理，为便携式及现场病毒检测提供强有力潜力。

该研究旨在开发一种针对H9N2禽流感病毒的高灵敏度、无标记电化学适体传感器，以应对现有诊断方法在快速性、便携性及成本效益方面的不足。H9N2禽流感病毒作为全球广泛分布的低致病性流感亚型，不仅对亚洲、中东和非洲地区的禽类生产造成慢性经济损失，更重要的是其可跨种感染人类和猪，并作为基因储备库参与产生具有大流行潜力的新型重组流感毒株。当前主流的聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）虽具有高灵敏度和特异性，但受制于复杂的样本预处理、昂贵的试剂需求、专业操作人员及实验室基础设施，难以满足资源受限环境下的快速现场筛查需求。其他无标记方法如拉曼光谱、石英晶体微天平（QCM）和表面等离子体共振（SPR）虽可实现病毒蛋白直接检测，但仍依赖精密仪器，不适合快速现场应用。电化学生物传感器因其快速、灵敏且易于微型化的特点，为病原体检测提供了可行路径，但现有抗体基电化学传感器存在成本高、热稳定性差及批次间差异大等局限。适体（Aptamer）经系统进化配体指数富集（SELEX）技术筛选获得，具有稳定性高、易于修饰的优势，适合可控固定于电极表面。B4适体此前经毛细管电泳SELEX（CE-SELEX）筛选获得，对H9N2血凝素（HA）具有低纳摩尔级结合亲和力，且能结合完整H9N2病毒颗粒，但尚未被转化为生物传感器格式，存在分子识别与可部署传感之间的关键差距。

电极污染和适体聚集是无标记电化学适体传感器的主要障碍。导电纳米材料的引入为解决这些问题提供了有效途径。电化学还原氧化石墨烯（rGO）具有高导电性和大比表面积，可实现高效电子传递和稳定适体固定化；氧化铈纳米颗粒（CeO₂ NPs）通过氧空位介导的相互作用防止rGO重堆叠，增强电荷传递和界面稳定性。该分层纳米复合材料结合AuNPs后，不仅加速电子交换动力学，还提供腺嘌呤结合位点用于定向、无巯基适体附着。结合快速傅里叶变换方波伏安法（FFT-SWV），将时域电化学信号转换至频域以分离法拉第响应并抑制背景噪声，可显著提高信噪比、灵敏度和分析重现性。

研究采用的主要关键技术方法包括：第一，分子对接与分子动力学模拟技术，利用HDOCK服务器对B4适体及九条候选序列与H9血凝素蛋白（PDB ID: 1JSD）进行对接计算，评估结合稳定性与特异性；第二，纳米复合界面构建技术，通过超声分散制备CeO₂–氧化石墨烯（GO）复合物，采用计时电流法在?0.9 V恒电位下电沉积AuNPs，同步实现GO还原为rGO；第三，PolyA–PolyT修饰适体的定向固定化技术，利用3′端腺嘌呤富集序列与AuNPs的亲和作用实现无巯基、高密度的适体定向固定；第四，FFT-SWV信号采集与处理技术，使用自制恒电位仪，以Delphi 6.0开发软件施加激励波形并进行快速傅里叶变换数字信号处理，将部分模拟滤波功能转移至软件层面；第五，电化学表征技术，包括循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）表征界面组装过程，以[Fe(CN)₆]^3?/4?作为外球电化学探针监测界面变化。

结构与形貌表征结果表明，通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察到原始金表面光滑，GO沉积形成褶皱片状形，CeO₂嵌入后形成良好分散的球状结构，共还原后获得Au/nanoCeO₂–rGO/AuNPs致密网络结构，金纳米颗粒均匀分布，粒径约27 nm。能量色散X射线光谱（EDX）及元素映射证实碳、氧、铈、金元素均匀分布于整个复合电极表面，无局部富集或相分离现象。电化学表征结果显示，原始金电极[Fe(CN)₆]^3?/4?氧化还原峰形良好，GO修饰后峰电流降低且峰电位差（ΔE_p）增大，表明界面传阻增加；rGO/AuNPs共沉积后电流显著增强约163%，证实纳米复合材料对电子传递的促进作用；适体固定后因磷酸骨架负电荷排斥及物理位阻导致电流下降；H9N2病毒孵育后电流进一步降低，证实适体-病毒复合物形成及界面阻塞效应。EIS结果同样呈现电荷转移电阻（R_ct）依次递增的变化趋势，与CV结果高度一致。

分析条件优化方面，研究人员系统考察了AuNPs电沉积时间、pH值、适体浓度与孵育时间、病毒孵育时间等环境参数，以及FFT-SWV的频率、振幅等仪器参数。AuNPs电沉积250 s时信号最优，过短导致覆盖不足，过长则引起颗粒团聚；pH 7.5时适体-血凝素相互作用最佳；5 μmol L^?1适体浓度和8 h固定化时间、90 min病毒孵育时间为最优条件；FFT-SWV最优参数为177 Hz频率、20 mV振幅和120个方波周期。

分析性能评价结果表明，适体传感器在1.0 × 10¹至1.0 × 10⁵ PFU mL^?1浓度范围内呈良好线性关系，线性方程为ΔI_p = 16.606 log C + 25.137（R² = 0.9933），检测限（LOD）为0.249 PFU mL^?1，相对标准偏差（RSD）为3.24%。信号关闭机制源于适体-病毒复合物形成后对[Fe(CN)₆]^3?/4?探针电子传递和物质传输的阻碍，尤其H9N2病毒颗粒体积较大，产生显著空间位阻效应。选择性实验表明，该传感器对H9N2响应最高（100%），对流感疫苗中的H1N1、H3N2、H5N8及流感B亚型响应极低（6%–10%），对H5N8单独样本响应仅6%，显示优异的选择性。在不使用化学稳定剂的条件下，传感器于4 °C保存10天信号保持100%，12天降至78%，仍具可接受稳定性；五次重复测量RSD为3.54%，重现性良好。

分子对接计算结果为B4适体的实验选择提供了分子层面支持。十条候选适体的综合评估显示，A6、A21和B25的对接打分虽优于B4，但其配体均方根偏差（RMSD）值较高，表明结合姿态分散、缺乏明确识别界面。B4则以?273.47 kcal mol^?1的对接打分、0.9216的置信度、70.53 ?的RMSD及最低实验解离常数（K_d = 7.38 ± 1.09 nM）展现出最均衡的综评表现。B4与HA蛋白的静电表面分析显示其优先结合于富含正电荷的表面暴露区域，关键残基Lys303、Tyr299、Gly301、Thr281和Thr282参与稳定界面，Arg276、Tyr299、Asn280和Lys303与适体核苷酸DG19、DG20、DC28形成氢键和静电相互作用，17个氢键分布于46个相互作用残基关系中。序列分析表明18–31位核苷酸主要参与HA识别，采用5′端结合取向，3′端保持可及性以用于电极固定化，与设计意图完全吻合。

讨论部分指出，与现有H9N2电化学检测平台相比，该适体传感器在简化制备流程、消除标记物需求、降低检测限方面具有显著优势。传统抗体基系统需多步制备、偶联反应并依赖蛋白稳定性，而本平台通过PolyA–PolyT修饰实现无巯基、定向控制的适体固定，结合rGO–CeO₂–AuNP纳米复合界面和FFT-SWV频域信号处理，实现了0.249 PFU mL^?1的超低检测限，优于所有已报道的H9N2电化学检测系统。

结论部分指出，H9N2禽流感病毒是一种流行病学重要但监测不足的共患病原体，充当具有大流行潜力的新兴流感毒株的基因储备库。尽管具有这一重要性，针对H9N2的电化学生物传感策略仍然有限，特别是能够在复杂生物环境中提供高灵敏度和鲁棒性的策略。该研究通过呈现一种专门为H9N2检测设计的无标记电化学适体传感器填补了这一空白，该传感器通过组合实验和分子层面分析进行验证。值得注意的是，据研究人员所知，该工作首次将B4抗H9N2血凝素适体作为生物识别元件进行生物传感器实施，将其先前报道的亲和力转化为分析传感平台。AuE/nanoCeO₂–rGO/AuNPs传感界面为适体固定化和靶标结合时的有效界面电荷传递调制提供了导电且结构有利的平台。该研究的关键创新在于快速傅里叶变换方波伏安法（FFT-SWV）的实施，该技术能够在抑制电容背景和低频噪声的同时实现频率域法拉第信号的提取。这一信号处理优势显著改善了信噪比，实现了0.249 PFU mL^?1的低检测限、低相对标准偏差和宽线性响应范围。观察到的信号关闭行为源于非导电适体-病毒复合物的形成，该复合物阻碍了[Fe(CN)₆]^3?/4?探针的电子传递。分子对接分析独立证实了这一机制，揭示了所选B4适体与H9血凝素蛋白之间良好定义且静电有利的相互作用。计算相互作用特征与实验结合亲和力之间的一致性验证了适体选择策略并支持了电化学响应机制。总体而言，该研究表明，合理的纳米界面工程与频率域电化学信号处理相结合，为超灵敏病毒检测提供了一种强大且未充分探索的方法。模块化设计和FFT-SWV读出使该平台易于适应其他病毒或蛋白靶标，凸显了其在未来电化学诊断和早期预警生物传感应用中的潜力。