氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)涂层提高三维(3D)打印生物反应器内生物膜密度与稳健性

《ACS Applied Polymer Materials》：Graphene Oxide Coatings Increase Biofilm Density and Robustness within 3D-Printed Bioreactors

　　

研究人员证明，与未涂层生物反应器相比，经氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)涂层及GO浸渍(impregnated)的生物膜生物反应器能促进成膜细菌大西洋海洋杆菌(Marinobacter atlanticus)更快的生长速率及更强的细胞黏附。初步实验发现，用GO–水溶液(GO-in-H2O)处理的3D打印生物反应器片段比未涂层片段或用GO–甲醇(GO-in-MeOH)、GO–异丙醇(GO-in-IPA)溶液涂层或浸渍的片段具有更大的生物膜覆盖率。补充实验表明，GO浓度与细菌增殖或抑制之间存在权衡关系：用0.1 wt % GO-in-H2O涂层10次的生物反应器片段经共聚焦显微镜观察可见厚生物膜形成，但结晶紫(crystal violet)测定显示生物膜形成量随涂层次数增加而下降；结合原子力显微镜(AFM)分析，结晶紫结果表明生物膜形成量与GO涂层片段的表面粗糙度密切相关，而粗糙度受涂层次数影响。上述结果与前人研究一致，即微生物与GO的相互作用受GO引入方式、GO表面粗糙度及微生物特性等多因素影响。在连续流生物反应器实验中，M. atlanticus生物膜在GO浸渍生物反应器中5小时(h)达>98%耗氧率(O2消耗)，GO涂层生物反应器为11 h，而未改性生物反应器需14 h，表明GO改性体系内生长显著加快。这些结果说明将GO引入聚合物材料可促进细菌增殖及靶向生物膜形成，在生物制造(biomanufacturing)领域具应用潜力。

论文解读：氧化石墨烯(GO)涂层提高3D打印生物反应器内生物膜密度与稳健性

《ACS Applied Polymer Materials》刊发的本研究针对当前生物膜生物反应器依赖厚层微生物细胞进行生物制造时常受限于培养基中氧气(O₂)可利用性，且3D打印(additive manufacturing)树脂基材表面细胞初始黏附与生物膜形成能力不足的问题，探讨将氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)通过涂层(coating)或浸渍(impregnation，即将GO引入未完全固化的树脂层后共同固化)方式引入3D打印聚合物生物反应器，能否促进大西洋海洋杆菌(Marinobacter atlanticus)的细胞黏附、增殖及致密生物膜形成，并解析GO引入方式、分散溶剂（水H₂O、甲醇MeOH、异丙醇IPA）、涂层次数对表面粗糙度及最终生物膜表型的影响。研究人员使用Formlabs BioMed Amber树脂3D打印模块化生物反应器，分别制备未涂层、GO-in-H₂O / GO-in-MeOH / GO-in-IPA浸渍（UV固化前引入），以及不同次数（1×、5×、10×）GO-in-H₂O或GO-in-MeOH涂层（UV固化后涂覆）的样品，通过扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)、结晶紫(crystal violet)生物膜定量、蛋白定量、高效液相色谱(HPLC)及连续流生物反应器溶氧(O₂)监测等指标进行评价。研究得出结论：GO-in-H₂O涂层及GO-in-MeOH浸渍可显著提升M. atlanticus初始细胞黏附与生物膜生长速率，其中GO浸渍生物反应器效果最优；生物膜形成与GO改性表面的粗糙度正相关，且分散于液相的游离GO对菌体有浓度依赖性抑制，而表面固定化GO无此抑制；该结果为GO改性3D打印连续流发酵反应器提升生物制造产量提供了依据。

主要关键技术方法

研究人员采用Hummers法制备或市售GO配制成0.1 wt % GO-in-H₂O、GO-in-MeOH、GO-in-IPA溶液。3D打印生物反应器使用Formlabs Form 4B与BioMed Amber树脂成型，分为：(1) GO浸渍组——打印件未最终UV固化前浸入GO溶液使GO嵌入树脂表层再冲洗并二次UV固化；(2) GO涂层组——打印件完全UV固化后多次浸涂GO溶液并干燥。表面形貌通过SEM与轻敲模式AFM表征粗糙度(Ra及峰谷距)。M. atlanticus在低氮人工海水(ASW)培养基中30 ℃振荡或过夜培养后接种。生物膜定量采用24孔板结晶紫染色法分别测孔板壁与生物反应器段片OD_{595 nm}，贴壁生物量另用NaOH裂解法测蛋白浓度，活/死菌用SYTO 9/FM 4?64双染LSCM观察。连续流生物反应器接入溶氧传感器，以出口O₂恢复率(Recovery)及达完全耗氧(＜2% DO)所需时间评估初始黏附量与生物膜成熟速率，部分实验去除Wolfe's Trace Mineral Solution以考察微量元素影响。GO负载量通过UV–vis分光光度法测定浸涂前后溶液吸光度差计算。

Characterization of Graphene Oxide Solutions and Coatings（氧化石墨烯溶液与涂层表征）

通过SEM观察发现GO在IPA与MeOH中易聚集为大块堆叠颗粒，而在H₂O中呈较均匀薄片堆叠并形成更均质致密膜。AFM结果显示未涂层树脂平均粗糙度Ra≈11.2 nm；GO浸渍（无论溶剂）不改变表面粗糙度(p＞0.1)；GO-in-MeOH涂层5×使Ra显著升至70.6 nm(p＜0.01)，10×涂层Ra略降至40.2 nm但仍高于未涂层(p＜0.1)；GO-in-H₂O涂层10×使Ra升至61.4 nm(p＜0.01)且表面被连续GO毡覆盖。表明GO涂层—尤其GO-in-H₂O多次涂层—可有效提高表面粗糙度与GO覆盖面。

Graphene Oxide Coating Flask Experiments（氧化石墨烯涂层摇瓶实验）

将带不同GO处理段片的1/4生物反应器置入含M. atlanticus的500 mL摇瓶培养100 h。各组培养液终OD_{600 nm}、pH及琥珀酸钠(succinate)消耗量无显著差异(p＞0.05)；段片上提取蛋白量各组间也无统计差异(p＞0.05)，但显微定性见GO-in-IPA浸渍段片生物膜薄且覆盖少，GO-in-MeOH浸渍段片形成致密厚生物膜伴明亮单个菌体，GO-in-H₂O浸渍段片生物膜明显但荧光偏弱暗示密度较低，GO-in-MeOH涂层(5×/10×)段片生物膜稀疏，GO-in-H₂O涂层10×段片形成大块密集菌落与厚生物膜，证实GO引入方式及溶剂共同决定黏附与生物膜形态。

Visualization of Coatings and Biofilms Using Microscopy（涂层与生物膜显微可视化）

LSCM Z?stack证实GO-in-MeOH浸渍与GO-in-H₂O涂层10×段片上M. atlanticus形成多层次厚密生物膜，而GO-in-MeOH涂层段片仅见零星稀疏黏附。说明表面固定化GO可促进生物膜，但浸渍埋入式GO(in-MeOH)与水面多次涂层所形成外露GO形貌更利于M. atlanticus定植。

Growth and Crystal Violet Biofilm Assays（生长与结晶紫生物膜测定）

液相中添加游离GO(0.01–0.1 wt %)使M. atlanticus培养OD_{600 nm}显著低于对照(p＜0.001)且呈浓度依赖性抑制。24孔板内未涂层段片使孔壁与段片均有较高结晶紫吸附；1× GO-in-H₂O涂层段片使孔壁结晶紫吸附下降(p＜0.05)而段片自身吸附上升，说明细胞偏好黏附GO涂层表面；5× GO-in-H₂O涂层段片孔壁结晶紫吸附最低(p＜0.01)，段片吸附与1×相当(p＞0.1)；10×涂层段片段片吸附与5×相近。表明适量GO-in-H₂O涂层可引导细胞选择性定植于生物反应器表面。

GO Depletion and Stability Assays（GO消耗与稳定性测定）

UV–vis法定量得GO-in-MeOH浸渍平均每段片嵌入12.71±0.39 μg/cm²GO，5× GO-in-H₂O涂层平均嵌入18.02±1.14 μg/cm²GO。流动剪切24 h后浸渍组无可量化GO脱落，涂层组全反应器(4段)平均脱落仅0.10±0.06 mg，说明两种引入方式具良好稳定性。

Continuous-Flow Bioreactor Experiments（连续流生物反应器实验）

含痕量元素培养基中未涂层生物反应器出口O₂恢复80.9%，完全耗氧时间14.2 h；GO-in-H₂O涂层5×恢复55.5%(p＜0.01)、完全耗氧10.5 h；GO-in-MeOH浸渍恢复40.5%(p＜0.01)、完全耗氧4.5 h(p＜0.01 vs 未涂层及vs GO涂层)。无痕量元素时未涂层与GO浸渍组恢复≈80%且24 h未完全耗氧，GO-in-H₂O涂层5×恢复≈78%但完全耗氧17.4 h仍快于未涂层，说明GO改性加速生长且在缺痕量元素时涂层仍有效，而浸渍效果依赖痕量元素协同。更低恢复率与更快耗氧指示GO促进初始细胞捕获与后续生物膜代谢活性。

讨论与结论总结

讨论指出GO对微生物具双重作用（促生物膜或抑菌），取决于GO浓度、存在形式（分散态vs表面固定化）、片层暴露程度、表面粗糙度及菌种特性。本研究中液相游离GO抑制生长，而表面固定化GO通过不可逆结合促进初始黏附，粗糙GO涂层引导细胞定殖生物反应器而非孔板壁。GO浸渍较涂层载入量少但嵌入树脂内部与表层，可能减少活性边缘暴露从而降低抑菌性并在痕量元素存在下获最佳促生长效果；GO-in-H₂O多次涂层则提供更高表面GO覆盖与适宜粗糙度。缺痕量元素时仅GO涂层仍加速生物膜成熟，可能与M. atlanticus胞外电子传递(EET)受GO电子介导有关，需进一步验证。

结论：GO引入方式、浓度及表面粗糙度共同调控GO–菌相互作用；将GO以涂层或浸渍方式加入3D打印生物反应器不会抑制M. atlanticus在人工海水培养基中的生长；M. atlanticus细胞倾向黏附GO改性表面；GO改性3D打印连续流模块生物反应器内M. atlanticus形成致密稳固生物膜速度快于未改性系统；多层GO-in-H₂O水溶液涂层可提供最佳表面覆盖与最高附着生物膜细胞密度，GO改性系统有望通过开发新型连续流发酵工艺提升生物制造能力而无需大型静态发酵罐。