通过反刍食丸追踪兽药：一种评估鸟类食腐动物暴露风险的非侵入性监测方法

《Environmental Science & Technology》：Tracing Veterinary Pharmaceuticals through Regurgitated Pellets: A Noninvasive Monitoring Approach to Assess Exposure in Avian Scavengers

　　

野生动物可通过摄入受污染的水和食物暴露于兽用药剂产品，但药用牲畜的尸骸是鸟类食腐动物最直接且最重要的暴露来源，甚至可能对其保护构成重大风险。南亚地区最具代表性的案例是：非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID）双氯芬酸用于 cattle 及其他牲畜后，导致鹫属（Gyps）秃鹫（G. bengalensis、G. indicus 和 G. tenuirostris）种群数量锐减99%，濒临灭绝。尽管已有研究揭示了双氯芬酸对亚洲鹫属秃鹫种群的影响，但该抗炎药于2013年在西班牙获批用于兽医领域，并于2020年导致了首只乌秃鹫（cinereous vulture, Aegypius monachus）的死亡记录。虽然迄今双氯芬酸在西班牙秃鹫中的影响尚不及南亚地区灾难性，但仍需持续监测，因其使用频率可能上升。此外，酮洛芬（ketoprofen）、卡洛芬（carprofen）、醋氯芬酸（aceclofenac）、氟尼辛（flunixin）和尼美舒利（nimesulide）等其他NSAIDs也被确认对秃鹫具有高度毒性，应予以监测，因其可能严重影响秃鹫种群。西班牙已报道氟尼辛导致秃鹫中毒的事件。除NSAIDs外，用于动物安乐死的巴比妥类（barbiturates）等兽用药物在尸骸处置不当时亦会造成鸟类食腐动物的致死性中毒。此外，西班牙近期研究发现，补充投喂站（supplementary feeding site, SFS）供应的牲畜尸骸中54.1%存在兽用药物（主要为抗生素），死亡野生食腐鸟类组织中51.7%检出药物，活体捕获鸟类血浆中28.5%检出药物。

模型评估显示，仅0.13%至0.75%的有蹄类尸骸受到致死水平双氯芬酸污染，即可导致食腐动物种群每年下降约30%。鉴于严重后果可能迅速显现，持续全面的监测对于评估和管理秃鹫种群的毒理学风险至关重要。鉴于采集被食腐尸骸或活体秃鹫样本困难，采集反刍食丸进行非侵入性分析是更简便的替代方案。食丸已被用于评估塑料或铅弹的摄入，化学物质分析亦被用于评估抗凝血灭鼠剂对仓鸮（Tyto alba）的风险。迄今尚无食腐动物食丸中兽用药物的研究，但该技术可促进大规模研究而无需更侵入性和耗时的操作。

本研究目的为：（1）研究44种关注药物在自然紫外线和温度变化条件下的鹫属食丸中的稳定性；（2）将分析方法应用于西班牙不同地区SFS附近野生秃鹫食丸的药物检测，以确定暴露流行率；（3）通过鉴定食丸中的猎物类型（家养、野生或混合），建立药物存在与秃鹫食性的关联。

## 研究背景与问题

鸟类食腐动物，特别是鹫属（Gyps）秃鹫，作为生态系统中的关键种，在维持生态平衡方面发挥着不可替代的作用。然而，这些受威胁物种正面临着严重的兽药暴露风险，其主要途径为摄食经药物处理的牲畜尸骸。历史上，NSAIDs尤其是双氯芬酸在亚洲造成的生态灾难性后果——导致三种Gyps秃鹫种群数量锐减99%——已成为全球野生动物毒理学研究的警示案例。尽管后续研究推动了该药物的使用管控，但2013年西班牙批准双氯芬酸用于兽医领域，并于2020年记录到首例乌秃鹫死亡事件，表明欧洲地区同样存在严峻风险。除NSAIDs外，抗生素、抗寄生虫药及安乐死药物（如巴比妥类）亦可通过食物链传递，对食腐鸟类构成威胁。

当前毒理学监测面临的核心难题在于：直接采集被食腐尸骸或活体秃鹫样本存在操作困难、成本高昂且对动物造成干扰等局限。因此，开发一种非侵入性、可大规模推广的监测手段成为迫切需求。反刍食丸作为秃鹫消化过程中形成的特殊基质，含有未完全消化食物残渣，且采集过程对动物无伤害，但其作为兽药残留载体的适用性尚未得到验证。研究人员基于此背景，系统评估了食丸作为非侵入性监测工具的可行性。

## 研究设计与主要结论

研究人员开展了三方面核心工作：药物稳定性实验、野外食丸检测分析、以及药物暴露与食性关联研究。主要结论表明：多数兽用药物在食丸中具有较高的环境稳定性（两周内可检出量仍超过初始加标量的50%）；292份食丸中44.2%检出兽药，以抗生素为主（43.5%），NSAIDs占2.0%；含家畜遗骸的食丸药物检出率（48.2%）显著高于仅含野生有蹄类遗骸者（20.0%）；猪遗骸与药物存在显著正相关。该研究建立了首个基于反刍食丸的食腐鸟类兽药暴露监测方法，证实其可作为传统生物样本采集的有效替代方案，相关成果发表于《Environmental Science》。

## 关键技术方法

本研究采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱（liquid chromatography with electrospray ionization mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS）作为核心检测技术，具体使用Agilent 6470 LC串联G7104A三重四极杆质谱仪，配合Poroshell-120EC-C18色谱柱（2.1 × 150 mm, 2.7 μm）进行分离。样本基质前处理采用改良QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe） dispersive净化方法，以C18和MgSO₄去除生物基质干扰。定量分析采用基质匹配校准曲线，以氘代同位素内标（enrofloxacin-d₅和flunixin-d₃）校正基质效应。稳定性实验于2023年7月开展，将加标食丸置于户外自然条件（日间温度>35°C，无降雨）下暴露，分别于24小时、48小时、96小时、1周、2周和1个月取样分析。野外样本采集于2021年至2024年间在西班牙Aragón、Castilla-La Mancha、Castilla y León、La Rioja和Navarra五个自治区的19处鹫属秃鹫（Gyps fulvus）栖息地进行，共计292份，均采集自SFS附近。猎物鉴定依据De Marinis和Asprea（2006）开发的毛发显微鉴定方法，通过髓质和角质层特征区分野生与家养有蹄类。统计分析采用广义线性模型（Generalized Linear Models, GLMs），以二项分布（药物存在/不存在）评估猎物类型与药物检出的关联性，模型选择基于Akaike信息准则校正小样本量版（Akaike's Information Criterion corrected for small sample size, AICc）。

## 研究结果

### 药物稳定性评估

研究人员对44种兽用药物在食丸中的稳定性进行了系统评估。结果显示，在户外环境条件下，所有测试药物均可检出长达28天。其中4种药物（氯霉素chloramphenicol及3种NSAIDs：卡洛芬carprofen、吲哚美辛indomethacin、苯基保泰松phenylbutazone）在初始时点（time 0）信号即较低，被排除于稳定性分析。抗菌药物整体稳定性优于NSAIDs和东莨菪碱（scopolamine）。研究关注的核心药物（（即抗菌药物和NSAIDs）在14天内浓度保持在初始加标量的50%以上。稳定性差异可能源于化合物对紫外线和温度波动的敏感性不同。值得注意的是，户外条件下基质组成的细微变化可能导致部分药物出现浓度波动甚至假性升高，这与有机质减少影响离子化效率有关。为降低基质效应，研究中采用了基质匹配校准和内标法，但标准加入法或提取稀释法可作为进一步优化方向。该部分结论证实了食丸用于长期野外研究的可行性，但提示对光敏性化合物应优先采集新鲜样本。

### 食丸中药物检出情况

本研究首次在食腐鸟类食丸中检出兽药残留。292份食丸中129份（44.2%）检出药物：127份含抗生素（43.5%），6份含NSAIDs（2.1%），4份同时含两类药物（1.4%）。药物浓度范围呈现显著差异，以喹诺酮类（quinolones）恩诺沙星（enrofloxacin）最高平均浓度30.3 ng/g（最大548.0 ng/g），四环素类（tetracyclines）土霉素（oxytetracycline）检出最高浓度达63,179.7 ng/g——但该结果需谨慎解读，因方法验证中该药回收率未达标准范围。药物种类组合模式反映出兽医临床用药特征：环丙沙星（ciprofloxacin）与恩诺沙星常共存（33例，因前者为后者代谢产物），林可霉素（lincomycin）与恩诺沙星（12例），磺胺嘧啶（sulfadiazine）与甲氧苄啶（trimethoprim）复方制剂（12例）。

NSAIDs仅检出氟尼辛（6份）和美洛昔康（meloxicam, 1份）。氟尼辛全部检出于Los Rábanos SFS，浓度最高45.0 ng/g，提示该处存在高剂量处理尸骸投喂。该药物对Gyps秃鹫的潜在毒性剂量为1–5 mg/kg体重，7 kg体重的 Griffon 秃鹫每日摄食0.5 kg时，对应猎物浓度阈值为14 mg/kg。虽然检测浓度远低于急性毒性水平，但其在三处地点的持续检出表明该高毒性药物已进入西班牙食腐鸟类食物链。

抗生素中检出频率最高者为恩诺沙星（66例，22.6%）、林可霉素（42例，14.4%）、环丙沙星（35例，12.0%）、甲氧苄啶（22例，7.5%）、磺胺嘧啶（19例，6.5%）和土霉素（17例，5.8%）。首次在该研究背景下检出的药物包括泰妙菌素（tiamulin）、磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole）和金霉素（chlortetracycline）。四环素类虽检出浓度显著，但其方法学局限性要求结果需谨慎解读。

### 药物存在的影响因素

食性分析显示，猪遗骸在食丸中出现频率最高（61.6%，180/292），其次为山羊（25.7%，75/292）、鹿类（33.6%，98/292）、家禽（24.3%，71/292）、绵羊（20.5%，60/292）和野猪（2.7%，8/292）。仅含家畜遗骸的食丸药物检出率（48.2%，91/189）显著高于仅含野生有蹄类者（20.0%，5/25）（Wald's χ² = 7.582, d.f. = 1, p = 0.014）。混合类型食丸检出率为42.3%，与纯家畜类型无显著差异。NSAIDs在纯野生有蹄类食丸中未检出。

物种水平分析证实，猪遗骸与药物检出存在显著正相关（Wald's χ² = 15.244, d.f. = 1, p < 0.001）；绵羊遗骸存在则与药物浓度呈边缘显著负相关（Wald's χ² = 3.768, d.f. = 1, p = 0.052）。这一差异与集约化与粗放化养殖模式的兽药使用强度差异，以及不同物种间药物代谢动力学差异相关——如喹诺酮类在猪肝肾中的累积半衰期可长达240小时，显著高于绵羊、兔或鸡等物种。

区域差异分析显示，Aragón和Castilla y León两自治区药物检出率显著高于其他区域（Wald's χ² = 8.097, d.f. = 1, p = 0.004），可能与当地密集养猪业及SFSs的尸骸管理实践有关。Morata点位居细（76.9%），而Berlanga和Guadalajara两处则无药物检出（0%）。

年份和季节在模型中未显示出显著差异，但Los Rábanos SFS的重复采样揭示了抗生素使用的时间动态变化：2021年3月至2022年7月期间恩诺沙星占主导，而2022年12月至2024年2月期间林可霉素成为主要检出药物。2024年2月的对照实验（清除旧食丸后一周重新采样）显示，基于形态、质地和湿度选择新鲜食丸的方法可有效反映当前暴露状况。

### 保护与监管意义

本研究首次在多种兽用药物于食腐鸟类食丸中被检出，验证了该非侵入性方法在毒理学监测中的应用价值。多数分析化合物在自然户外条件下具有足够稳定性，使得基于食丸的监测可与牲畜尸骸及野生动物生物样本的检测结果相媲美。研究确认西班牙秃鹫暴露于多种兽药，与此前基于血浆和组织样本的研究结论一致。

食丸中药物流行率与食性组成存在正相关关系，尸骸管理强度及养殖场类型是驱动药物暴露的关键因素。猪遗骸关联的集约化养殖模式与更高的药物检出率相关，而绵羊羊毛关联的粗放化养殖模式则相反。尽管NSAIDs的相对毒性已被认知，氟尼辛仍在秃鹫营养级中被持续检出。

基于上述发现，研究人员建议从以下方面改进监管：加强SFSs供应尸骸的法规管控；提升利益相关方之间的信息沟通，防止经药物治疗的家畜尸骸进入投喂体系；推广已注册确认安全的NSAIDs替代药物（如美洛昔康和托芬那酸，tolufenamic acid）。同时将安全性测试作为此类药物审批的优先事项，特别是针对Gyps秃鹫的毒性阈值和作用机制研究，以评估在秃鹫种群仍受威胁地区禁用氟尼辛的必要性，并预防暴露风险。

研究结论：多种兽用药物首次在鸟类食腐动物食丸中被检出。本研究中大多数分析化合物在该基质中于户外条件下具有足够的稳定性，即使经过一个月仍可检出。这些发现突显了本研究开发的方法作为一种非侵入性监测工具的价值，其检测到的药物流行率与野生秃鹫及可供其取食的牲畜尸骸中观察到的水平相当。研究结果证实西班牙秃鹫暴露于多种兽药，与此前分析其他生物基质（如血浆或组织）所得结果一致。此外，Griffon秃鹫食丸中的药物流行率与食性组成呈正相关。用于投喂点尸骸供应的养殖管理强度和类型似乎是药物暴露的关键驱动因素。含猪遗骸的食丸通常与集约化管理相关，其药物检出率高于由绵羊毛组成的食丸——后者与粗放式畜牧业相关。此外，尽管已知NSAIDs的相对毒性，氟尼辛仍在秃鹫的营养级中被持续检测到。因此，为保护野生秃鹫种群，研究人员建议改进用于秃鹫投喂的尸骸供应法规，并加强利益相关者之间的沟通，以防止经药物治疗的家畜尸骸被输送至补充投喂站，同时推广使用已注册且安全的NSAIDs如美洛昔康和托芬那酸。缓解措施应与此类药物在Gyps秃鹫上的优先安全性测试同步实施，以解决有关毒性阈值和作用机制的知识空白。这些信息可用于评估在秃鹫种群仍受威胁的地区禁用氟尼辛的必要性，并预防其暴露。