用于从CO2全新合成癸酸的微生物-酶杂合电合成体系

《JACS Au》：Hybrid Microbial-Enzymatic Electrosynthesis for De Novo Decanoic Acid Production from CO2

　　

大气中CO₂浓度的持续升高是人为气候变化的关键驱动因素，因而引发了全球范围的广泛关注。在此背景下，将CO₂可持续地转化为高附加值化学品，被认为是实现碳中和制造与绿色化学的一条极具吸引力的路径。该研究构建了一种概念验证性的微生物-酶杂合电合成系统，将微生物电合成（MES）与酶电合成（EES）相结合，在常温常压条件下利用电能将CO₂转化为癸酸。在MES模块中，CO₂通过Clostridium ljungdahlii的Wood–Ljungdahl途径（WLP）被转化为乙酸，其中电子供体为电化学水裂解产生的H₂。在下游EES模块中，乙酸首先转化为乙酰辅酶A（acetyl-CoA），随后在体外逆β-氧化（rBOX）途径中，在生物电催化NADH再生驱动下延长碳链生成癸酸。为验证两个模块之间的功能耦联，研究采用¹³C同位素标记追踪碳流，从CO₂到乙酸，再进一步到癸酸，证实MES来源的碳可直接作为EES模块下游链延长的前体。在优化条件下，该杂合MES-EES系统可生成0.80 mM癸酸，产物特异性达到81.3%。这些结果表明，MES与EES的成功杂合实现了由CO₂到癸酸的从头生物电合成，并为CO₂资源化利用与可再生电能耦合提供了一种有前景的策略。

该研究发表于《JACS Au》，聚焦于CO₂深度转化中“由简单中间体到复杂高碳产物”这一关键瓶颈，提出并验证了一种微生物电合成（MES）与酶电合成（EES）串联的杂合生物电合成平台，用于在温和条件下将CO₂从头转化为中链脂肪酸癸酸。研究背景在于，虽然利用可再生电能驱动CO₂转化已能获得一氧化碳、甲酸、乙烯、乙酸、乙醇等C₁或C₂产物，但直接获得具有更长碳链、更高能量密度和更复杂结构的化合物仍然十分困难。这一困难主要源于CO₂本身化学惰性强，且深度转化过程需要跨越较高的C–C偶联能垒，并涉及复杂的多质子/多电子转移过程。癸酸作为一种典型C₁₀中链脂肪酸，兼具抗菌剂、食品添加剂、橡胶加工助剂和润滑增稠剂等多方面工业用途，其甲酯和乙酯还具有较高能量密度，因此是具有应用前景的“即用型”生物燃料前体和高能化学原料。传统石油路线经济性受限，植物提取又受产率低和与粮食资源竞争等因素制约，因此开发以CO₂等非食用可再生碳源为原料的新路线具有重要意义。

针对上述问题，研究人员构建了一个由两个顺序耦联模块组成的概念验证系统。上游MES模块负责将CO₂还原为乙酸，下游EES模块则以乙酸为底物，经乙酰辅酶A（acetyl-CoA）中间体和逆β-氧化（rBOX，reverse β-oxidation）途径进行碳链延长，最终高选择性生成癸酸。研究得出的核心结论是：该杂合系统成功实现了从CO₂到C₁₀脂肪酸的全流程电驱动生物转化；¹³C同位素示踪证实了上游MES固定的碳直接流入下游EES并参与癸酸生物合成；在优化条件下系统可获得0.80 mM癸酸，特异性为81.3%。这表明，将微生物CO₂固定能力与多酶级联高选择性链延长能力相结合，是实现CO₂深度升级利用的一种可行框架，也为面向更多乙酰辅酶A衍生物的模块化设计提供了基础。

作者开展研究所使用的主要关键技术方法可概括如下：首先，利用H型双室电解池构建MES体系，在阳极进行水氧化、阴极进行析氢反应（HER），并以Nafion质子交换膜（PEM）分隔双室；随后使用Clostridium ljungdahlii DSM 13528通过Wood–Ljungdahl途径（WLP，一种厌氧固碳途径）将CO₂转化为乙酸。其次，构建包含ACS、PPK、BktB、FadB、TER、YdiI和DI的体外多酶级联EES体系，通过ATP原位再生和NADH电化学再生支撑rBOX链延长。再次，采用循环伏安（CV）、线性扫描伏安（LSV）、计时电流（chronoamperometry）等电化学手段表征电子转移与辅酶再生行为，并通过GC-MS和LC-MS结合¹³C同位素标记追踪碳流，验证模块间功能耦联。研究未涉及人群样本队列来源。

在研究结果部分，论文首先以“Design of a Hybrid Microbial-Enzymatic Electrosynthesis System for Decanoic Acid Production from CO₂”为题，阐述了整个杂合体系的设计逻辑。研究人员将CO₂到癸酸的转化拆分为两个相互衔接但物理分离的功能模块。模块I中，阳极水氧化提供质子和电子，质子穿过PEM进入阴极室后在阴极表面经HER生成H₂，C. ljungdahlii再利用氢化酶氧化原位生成的H₂，产生NADH、NADPH和还原型铁氧还蛋白等还原当量，驱动WLP进行厌氧固碳并合成乙酸。模块II中，乙酸经ACS活化为乙酰辅酶A，ATP由PPK原位再生；随后乙酰辅酶A进入由BktB、FadB、TER组成的rBOX循环逐步延长碳链，形成癸酰辅酶A，最后由YdiI水解释放癸酸并回收辅酶A。由于rBOX依赖持续的还原力供给，系统进一步引入DI和甲基紫精（MV²⁺）介导的NADH再生路径，使阴极电子可被转移至NAD⁺形成NADH。该部分结果说明，研究并非简单叠加两个反应，而是构建了一个围绕碳流和电子流顺序耦合的电驱动多级生物转化平台。

在“Module I: CO₂-to-Acetate Conversion through MES”部分，研究人员系统验证了MES模块对CO₂向乙酸转化的可行性。结果显示，在持续通入CO₂并保持HER存在的条件下，C. ljungdahlii细胞密度随时间上升，72 h达到最大；乙酸浓度也持续积累，在72 h达到5.59 mM，折算滴度为335 mg·L^–1，生产速率最高为84 mg·L^–1·d^–1。同时仅检测到少量乙醇副产物。缺失CO₂或缺失供电的对照组均未观察到显著生长或乙酸积累，说明CO₂作为碳源、HER产生的H₂作为电子供体，对系统运行是必要的。进一步的pH和LSV结果表明，阴极区确实发生了明显析氢，且生物存在会改变阴极极化行为。阳极侧分析显示，除氧析出反应（OER）外，还伴随一定程度的氯离子氧化，但PEM有效阻隔了含氯氧化物向阴极室迁移，因此未对菌体活性造成明显不利影响。¹³C标记实验进一步表明，生成乙酸中的碳主要源于外加¹³CO₂与NaH¹³CO₃，乙酸中¹³C与¹²C比例约为74:26，证实该模块实现了以CO₂为主体碳源的固定与活化。该部分结论是，MES模块能够有效将惰性C₁底物转化为活化的C₂中间体乙酸，为下游链延长提供了接口。

在“Optimizing the Enzymatic Pathway for Converting Acetate to Decanoic Acid”部分，研究重点转向EES酶级联中底物活化、能量再生与链长控制的优化。研究人员首先比较了三种无机多聚磷酸盐作为PPK催化ATP再生的磷供体，结果表明六偏磷酸钠（P6）最有利于乙酰辅酶A形成和癸酸生成，说明持续ATP再生对维持级联通量至关重要。随后，对关键酶负载量进行了系统筛选。ACS增加可提升乙酰辅酶A供给，BktB决定初始缩合与链延长效率，YdiI则影响末端水解和最终链长特异性。优化结果显示，在37.5 μM ACS、15 μM BktB、2 μM YdiI条件下，系统能够获得更高癸酸产量和更佳特异性。进一步对FadB、TER以及NADH浓度优化后，在辅酶充足条件下，1 h内癸酸最高达到0.81 mM，特异性约82%，并伴有0.12 mM辛酸和0.07 mM十二酸生成；5 mM乙酸的总体转化率约99%。这些结果建立了一个在还原力不受限条件下的“性能基准”，用于后续评估真正电驱动EES体系的表现，同时也说明rBOX体系具有较好的C₁₀选择性，但仍存在少量链长偏短或偏长副产物。

在“Module II: Acetate-to-Decanoic Acid Conversion via EES”部分，研究人员重点证明了电驱动NADH再生能够支撑乙酸向癸酸的转化。由于合成1分子癸酸需要5分子乙酸和8分子NADH，仅依赖外源高浓度NADH并不现实，因此作者采用MV²⁺/DI/NAD⁺体系进行生物电催化辅酶再生。CV结果显示，MV²⁺在约?0.73 V vs SCE发生特征氧化还原反应，加入DI和NAD⁺后同一区域出现更明显催化波，证明阴极电子经MV²⁺介导并由DI催化传递至NAD⁺。随后优化DI用量和工作电位，确定60 μM DI与?0.80 V vs SCE为较优条件。计时电流结果进一步显示，在DI和MV²⁺同时存在时，加入NAD⁺后出现显著还原电流响应，而缺失二者的对照组无此现象，证实电极—介体—酶—辅酶的电子传递路径有效。功能输出方面，EES模块中癸酸浓度随时间稳定升高，3 h达到0.80 mM，同时生成0.09 mM辛酸和0.10 mM十二酸，癸酸特异性为81.3%；总脂肪酸转化率为98.8%。法拉第效率方面，癸酸合成峰值约68.6%，总脂肪酸峰值约82.4%，表明电输入能够较高效地用于目标转化。尽管与直接补加30 mM NADH的酶体系相比，电驱动条件下癸酸生成速率较低，但作者明确指出，该差异主要反映了NADH电再生速率仍是当前限制因素，而非rBOX级联本身失效。延长至24 h补料运行时，癸酸可进一步积累至约2.56 mM，特异性仍保持在约80%，说明体系具备一定持续运行能力；不过电流峰值和CV响应逐渐衰减，提示长期性能受酶失活、介体稳定性或反应环境变化限制。

同位素验证也是本研究结果中的关键环节。研究人员在MES阶段使用¹³CO₂和NaH¹³CO₃制备带标记乙酸，并在未经纯化或替换的情况下直接作为EES底物。LC-MS同位素体分析显示，所得辛酸、癸酸和十二酸中均掺入了¹³C，且癸酸、辛酸、十二酸中的¹³C比例分别约为73.59%、73.91%和72.91%，与MES产生乙酸的标记模式基本一致。该结果直接证明，上游由CO₂固定而来的碳被连续地输送至下游rBOX途径，并最终构建成中链脂肪酸骨架，从而在实验证据层面确认了“CO₂→乙酸→癸酸”的功能一体化碳流。

从讨论部分来看，作者强调本研究的价值在于提出并验证了一个可模块化拓展的电驱动CO₂深度生物转化框架。MES模块能够以微生物代谢实现对CO₂的温和固定，EES模块则利用多酶级联和电化学辅酶再生，实现对活化C₂中间体的高选择性链延长，两者的结合有效绕开了单一电催化直接合成长链复杂产物的困难。与此同时，作者也指出当前系统仍属于概念验证水平：MES端的乙酸滴度、生产率和表观法拉第效率尚不高；EES端则受NADH再生速率、电子传递效率、传质匹配和生物催化稳定性限制。后续优化方向包括改良电极材料、优化反应器构型、抑制阳极副反应、强化H₂捕获与界面电子转移、提升酶和介体稳定性，以及以空间限制或电极锚定的氧化还原聚合物替代游离介体等。总体而言，论文并未夸大现阶段产量，而是更强调策略本身的可扩展性与方法学意义。

研究结论部分可译述如下：该研究构建并实验验证了一种由MES与EES杂合组成的CO₂到C₁₀产物的生物转化系统，在温和条件下借助电能实现了化学惰性CO₂向癸酸的选择性转化。在MES模块中，CO₂通过电化学水裂解体系被活化，其中HER生成的H₂作为电子载体驱动C. ljungdahlii中的Wood–Ljungdahl途径生成乙酸这一关键连接中间体。在后续EES模块中，乙酸在ATP再生条件下转化为乙酰辅酶A，并作为rBOX循环的C₂延长单元；同时，MV²⁺/DI介导的电子传递实现了NADH再生，最终完成癸酸的选择性合成。尽管当前产物滴度仍然有限，这项工作确立了一条将电驱动CO₂固定与下游酶促碳链延长相耦合的概念验证路径。随着电极材料、反应器构型、传质、酶稳定性和辅酶再生等方面的进一步改进，整体系统性能有望持续提升。该杂合体系为利用CO₂、H₂O和可再生电力进行可持续、环境友好型化学制造提供了一种新方法；更广泛地说，该策略为拓展至其他乙酰辅酶A衍生物的电驱动CO₂转化提供了模块化框架，并有望结合MES中的微生物代谢工程与EES中的多酶级联设计，实现多种目标化合物的按需清洁电力合成。