四嗪介导的肽大环化及生物正交细胞穿透性评价(Bioorthogonal Cell Penetration Profiling)

《JACS Au》：Tetrazine-Enabled Peptide Macrocyclization and Bioorthogonal Cell Penetration Profiling

　　

将线性肽环化成大环结构可赋予其膜通透性增强、蛋白酶稳定性提高以及在保持高靶标亲和力和特异性的优势。本文提出一种半胱氨酸选择性大环化策略，利用氯乙基四嗪(chloroethyl tetrazine)的烷基化基团与未保护肽中半胱氨酸残基的巯基侧链反应，高效制备带有生物正交四嗪(handle)的大环肽，可通过稳健的四嗪连接反应(tetrazine ligation，即逆电子需求狄尔斯–阿尔德反应 inverse electron-demand Diels–Alder, IEDDA)进行精确的后期修饰。研究人员应用该方法合成并筛选了rofapitide tetraxetan类似物，鉴定出一株新型肽2o，在体外和体内均对癌相关成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)表现出强结合力。此外，研究人员基于含四嗪肽(Tz-Pep)与反式环辛烯(trans-cyclooctene, TCO)笼蔽尼罗蓝染料(TCO-Nile Blue)之间的"点击释放(click-to-release)"反应——释放荧光尼罗蓝——开发了创新的生物正交细胞穿透检测法(bioorthogonal cell penetration assay, BCPA)，可定量评估活细胞内肽的内化水平。该四嗪介导的环化策略与细胞穿透检测方法有望在生物学研究和药物发现中得到广泛应用。

研究背景与意义

线性肽因具有高特异性、低毒性和可合成性被视为重要治疗药物与研究工具，但其易受蛋白酶降解且细胞膜通透性差，限制了临床应用。将线性肽环化成大环(macrocyclic)结构可降低构象柔性，从而提高蛋白酶稳定性和膜通透性，同时维持靶标亲和力。传统环化方法包括内酰胺化(lactamization)和二硫键形成，近年也发展出利用半胱氨酸巯基与双官能团交联剂构建大环肽的方法，以及利用非天然氨基酸通过点击化学(click chemistry)、闭环复分解(ring-closing metathesis, RCM)等进行环化。然而，现有方法仍难以兼顾高化学选择性、高产率及在环化连接子中引入稳定生物正交标签以实现后期模块化修饰。四嗪(tetrazine)与反式环辛烯(trans-cyclooctene, TCO)间的逆电子需求狄尔斯–阿尔德反应(inverse electron-demand Diels–Alder, IEDDA)因动力学快、生物相容性好、无需催化剂而备受关注；此前报道的二氯四嗪或甲硫基四嗪与半胱氨酸形成的S-四嗪连接易发可逆硫醇交换或光解，稳定性不足。基于此，研究人员假设卤代烷基四嗪中芳基四嗪的吸电子效应可活化邻位卤素，使其与半胱氨酸巯基发生亲核取代或消除–迈克尔加成，形成更稳定的S-烷基底物四嗪(S-alkyl tetrazine)连接大环肽，并保留生物正交IEDDA反应性，可用于后期修饰及开发基于四嗪–TCO点击释放反应的细胞穿透定量检测法(bioorthogonal cell penetration assay, BCPA)。相关工作发表于《JACS Au》。

主要关键技术方法

研究人员设计合成了氯甲基、氯乙基及氯丙基苯基四嗪，筛选获得最优氯乙基苯基四嗪(chloroethyl phenyl tetrazine)；采用固相肽合成(solid-phase peptide synthesis, SPPS)制备含双半胱氨酸的各种线性肽，在弱碱甲醇/PBS体系中与氯乙基四嗪发生分子内大环化；设计N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)酯修饰的氯乙基四嗪实现一锅法(on?e?pot)环化及与TCO或双环[6.1.0]壬炔(bicyclo[6.1.0]nonyne, BCN)修饰分子的IEDDA后期功能化；通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)测定环化rofapitide tetraxetan类似物与重组人成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)的结合解离常数(K_D)；用共聚焦荧光显微镜和流式细胞术检测肽与细胞表面FAP的结合；以⁶⁸Ga标记BCN?DOTA偶联的优选环肽进行小鼠异种移植瘤正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)成像；建立BCPA法，利用Tz?Pep与TCO?Nile Blue的IEDDA点击释放反应，在96孔板中通过酶标仪定量胞内荧光以计算CP₅₀值。

研究结果

氯乙基四嗪介导的肽大环化(Chloroalkyl Tetrazine-Mediated Peptide Macrocyclization)

研究人员合成氯甲基(1a)、氯乙基(1b)、氯丙基(1c)苯基四嗪，在pH 8.0 PBS中与半胱氨酸及其他亲核氨基酸孵育。1a易降解且半胱氨酸选择性产物产率仅约10％；1b在存在多种竞争性氨基酸下仍得到81％半胱氨酸选择性产物；1c无反应，表明γ位氯未被四嗪足够活化。以模型线性七肽1d(含双Cys)优化条件，在MeOH/PBS(pH 7.4, 37 ℃, 3 h)得S-乙基四嗪连接大环肽2d产率86％，pH 8.0下近定量转化(99％)。动力学分析显示中性条件下氯乙基四嗪可发生消除生成乙烯基四嗪并与Cys发生迈克尔加成(Michael addition)，碱性条件下以消除–迈克尔途径为主，中性时亲核取代与消除–迈克尔并存。对不同长度、序列及已知生物活性肽(靶向肽、细胞毒肽、抗菌肽等)进行环化，均获71–97％分离产率，Ser、Thr、Arg、His、Trp、Asp等高活性残基不干扰反应，证明该方法化学选择性高、适用范围广，可得稳定S-乙基四嗪连接大环肽。

一锅法肽环化与后期功能化("One-Pot" Peptide Cyclization and Late-Stage Functionalization)

研究人员合成NHS酯修饰的氯乙基苯基四嗪(1m)，SPPS所得粗肽先与1m在吡啶中N端酰化引入四嗪，再加MeOH/二异丙基乙胺(diisopropylethylamine, DIPEA)完成分子内大环化，随后加入TCO或BCN修饰分子通过IEDDA反应进行后期修饰。模型环肽c(Tz?LIGANDC)分别与TCO?葡萄糖胺(glucamine, 产率42％)、BCN?甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E, MMAE, 38％)、BCN?DOTA(1,4,7,10?四氮杂环十二烷?1,4,7,10?四乙酸, 69％)、脂尾(28％)、生物素(biotin, 42％)及泊马度胺(pomalidomide, 47％)偶联成功，表明该方法可灵活引入糖、细胞毒药物、螯合剂、脂链及探针标签，适用于模块化肽药物偶联物(peptide–drug conjugates, PDCs)开发。

环四嗪Rofapitide Tetraxetan类似物的生物活性评价(Bioactivity Evaluation of Cyclic Tetrazine Rofapitide Tetraxetan Analogues)

以FAP靶向核心序列CPPTQFC经1,3?双(溴甲基)苯环化的对照肽2m(K_D=157 nM)为基准，研究人员用氯乙基四嗪环化合成N端带正亮氨酸(norleucine, Nle)及不同甘氨酸延伸的类似物2n–2p。SPR显示2nK_D=427 nM，2o(Nle+单Gly延伸) K_D=53 nM，2pK_D=3 μM；2o亲和力较2m提高约3倍，主要因解离速率常数k_d=4.46×10^?2s^?1，比2m(k_d=2.22×10^?1s^?1)低5倍。Nle替换为Ala(2q, K_D=517 nM)或Gly(2r, K_D=3180 nM)及Nle位置改变(2s,2t)均降低亲和力，说明Nle侧链长度及其特定位置对FAP结合至关重要。共聚焦与流式检测证实2o经IEDDA与TCO?Cy5偶联后特异性结合HT1080?FAP细胞表面FAP，平均荧光强度较对照组高20倍。将2o与BCN?DOTA偶联得3g(K_D=51 nM，不影响结合)，血清中线性前体1o24 h内基本降解，而环肽2o和3g半衰期>48 h。以⁶⁸Ga标记得[⁶⁸Ga]3g(放射化学产率>99％)，荷HT1080?FAP瘤小鼠PET/CT显示肿瘤摄取30 min达5.58±0.47％ID/g，明显高于肝、心及肌肉(≥5–6倍)，肿瘤/本底比值随时间升高，主要经肾?膀胱排泄，证明该环四嗪肽具优异体内FAP靶向与成像潜力。

基于四嗪化学的肽细胞穿透检测(Cell Penetration Assay of Peptides via Tetrazine Chemistry)

为解决传统荧光标记改变肽性质及HaloTag依赖的氯烷穿透检测(chloroalkane penetration assay, CAPA)局限，研究人员建立BCPA：含四嗪肽(Tz?Pep)与TCO?笼蔽尼罗蓝(TCO?Nile Blue)发生IEDDA点击释放反应，胞内Tz?Pep触发释放荧光尼罗蓝，酶标仪定量荧光。体外混合MeTz?R₉(2u)与TCO?Nile Blue 6 h达最大荧光，单独组分无荧光；活细胞中共孵育后可见随时间增强的胞内荧光。BCPA流程为细胞与Tz?Pep孵育→洗去胞外肽→加TCO?Nile Blue→测荧光，以CP₅₀(达半数最大荧光强度所需肽浓度)量化穿透能力。对标准穿膜肽2uCP₅₀=0.22 μM；环化穿膜肽2v(CP₅₀=0.23 μM)、2x(CP₅₀=0.42 μM)较其线性前体2w(0.77 μM)、2y(0.84 μM)穿透更强；C端酰胺化衍生物2z(CP₅₀=0.58 μM)优于未酰胺化2h(CP₅₀=2.8 μM)；带负电环四嗪肽2i穿透极差。BCPA无需遗传修饰、不依赖预标记荧光、可高通量定量评估肽细胞摄取。

总结与结论(Conclusions)

研究人员开发了氯乙基四嗪介导的未保护肽半胱氨酸选择性大环化新方法，所得S-乙基四嗪连接大环肽带有稳定生物正交四嗪handle，可通过IEDDA反应与多种功能模块(TCO/BCN修饰糖、毒素、DOTA、脂链、biotin、pomalidomide等)进行后期多样化修饰。筛选得到的环四嗪rofapitide tetraxetan类似物2o对人FAP具高亲和力(K_D=53 nM)，体内PET/CT证实其肿瘤靶向积累能力。基于四嗪–TCO点击释放反应建立的BCPA可无干扰、定量、高通量评价活细胞肽内化。该四嗪介导肽大环化、后期功能化策略及BCPA检测平台在肽药物偶联物(PDCs)、肽?放射性核素偶联物(peptide–radionuclide conjugates, PRCs)及探针开发中具广泛应用前景；BCPA亦可拓展至其它大分子或纳米材料细胞摄取定量研究。