外周血管疾病中的非编码RNA——一项snRNA（small nuclear RNA，小核RNA）研究

《Journal of Applied Genetics》：Non-coding RNAs in peripheral vascular diseases – a snRNA study

　　

摘要：下肢动脉疾病（lower extremity artery disease，LEAD）、腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）和慢性静脉疾病（chronic venous disease，CVD）是常被漏诊的血管性疾病，可显著导致发病、死亡及生活质量下降，构成重大公共卫生负担。发现新型分子生物标志物对改善早期诊断、实现精确危险分层、揭示发病机制及开发靶向治疗至关重要。本研究旨在探讨LEAD、AAA和CVD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中小核RNA（small nuclear RNAs，snRNAs）的表达改变。研究人员利用snRNA-seq数据及DESeq2软件包分析snRNA表达谱，并行采用miRNA-seq数据鉴定与snRNA失调相关的差异表达微RNA（microRNAs，miRNAs）。采用严格筛选标准，研究人员分别在LEAD和CVD患者中鉴定出4个（RNU6-4P、RNU6-18P、RNU6-36P和RNU2-48P）和2个（RNVU1-19和RNU1-146P）失调snRNAs；并利用IntaRNA平台通过计算机（in silico）预测与验证，发现3个涉及上述疾病差异表达miRNA与snRNA的相互作用。失调snRNAs内的遗传变异提示所选snRNAs与血管生物学存在潜在功能关联，尤其涉及血小板功能、血压调节及吸烟行为。上述结果强调snRNAs作为新型生物标志物的潜力，并为理解其在LEAD和CVD血管病理生理机制中的可能作用提供了线索。

论文解读：外周血管疾病中snRNA的表达改变及miRNA–snRNA调控关系探究

本研究发表于《Journal of Applied Genetics》。

一、研究背景与立题依据

外周血管疾病主要包括下肢动脉疾病（lower extremity artery disease，LEAD）、腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）及慢性静脉疾病（chronic venous disease，CVD），临床常因早期无症状或症状不典型而被漏诊，导致不良预后与沉重公共卫生负担。现有诊断多依赖影像学与部分血清指标，缺乏高灵敏度和特异性的分子生物标志物。小核RNA（small nuclear RNAs，snRNAs）是剪接体的核心组分之一，以往被视为组成性非编码RNA，近年研究显示其在氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）刺激的内皮细胞中显著差异表达，且与内皮凋亡、炎症相关；U1 snRNP还可调控长链非编码RNA MALAT1的染色质滞留，提示snRNA可能参与血管功能调节。然而snRNA在外周血管病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表达谱及与miRNA的调控关系尚未见系统报道。因此，研究人员通过分析LEAD、AAA、CVD患者及健康对照PBMCs的snRNA-seq与miRNA-seq数据，筛选差异表达snRNAs，预测并验证miRNA–snRNA互作，并结合GWAS Catalog挖掘snRNA遗传变异与血管表型的关联，以探索snRNA作为外周血管病新型分子标志物的可能性及潜在病理生理意义。

二、主要关键技术方法

研究人员使用既往生成的snRNA-seq数据集（涵盖1,916个snRNAs，hg19）和miRNA-seq数据集（涵盖2,792个人类miRNA转录本，miRBase v21），样本来源于40例LEAD患者、28例AAA患者、34例CVD患者及19例健康对照者静脉血分离之PBMCs。差异表达分析采用DESeq2软件包（R 4.3.2环境），进行疾病组vs对照组及疾病组间两两比较，并校正年龄、性别、BMI、吸烟状况、高血压、冠心病及心肌梗死史等混杂因素；低表达基因（均值raw read counts ≤10）被剔除。筛选差异表达snRNAs的标准为：归一化平均read counts >10、|log₂FC| >0.585、FDR <0.05及ROC-AUC >0.8。候选调控miRNA通过miRDB平台预测及Pearson相关性分析（|r|>0.5）获得。miRNA–snRNA互作经IntaRNA平台进行in silico验证。snRNA内遗传变异与表型关联查询GWAS Catalog数据库。ROC分析及十折交叉验证分别采用pROC与caret程序包完成。

三、研究结果

Results and discussion

在LEAD vs. 对照比较中，筛选出4个差异表达snRNAs：RNU6-4P、RNU6-18P、RNU6-36P和RNU2-48P；在CVD vs. 对照比较中，筛选出2个：RNVU1-19和RNU1-146P。AAA vs. 对照及其他疾病间比较未发现符合标准的snRNAs，提示snRNA失调在疾病—对照对比中较疾病间对比更为显著，LEAD与CVD组改变最突出。ROC分析显示所选snRNAs具良好判别效能，其中RNU2-48P之AUC达0.947。LEAD组内RNU6-4P与RNU6-36P呈中度正相关（R=0.55，P=2.04×10^?4），CVD组内RNVU1-19与RNU1-146P亦呈中度正相关（R=0.49，P=3.63×10^?3），提示协调调控可能。GWAS Catalog检索发现：RNU2-48P之rs62387962-T与血小板分布宽度相关，RNU6-18P之rs61323625-T与尼古丁依赖相关，RNU1-146P内多个变异与血压性状相关，支持snRNAs与血管病理生理的潜在联系。miRDB与相关分析共获45个候选miRNA–snRNA互作；在LEAD中hsa-miR-30e-3p与hsa-miR-766-3p（均下调）与上调之RNU2-48P呈反向表达且被IntaRNA预测可结合；在CVD中hsa-miR-454-3p（上调）与下调之RNU1-146P呈反向表达且被IntaRNA预测可结合。hsa-miR-766-3p具抗炎作用（间接抑制NF-κB），其降低可能放大LEAD中之炎症应答；hsa-miR-454-3p具促血管生成作用，其与RNU1-146P之调控轴可能参与静脉高压所致CVD之异常血管重塑。研究人员指出5/6个差异snRNAs属假基因来源，虽具转录活性及调控潜能，但不排除测序比对偏差，需实验验证。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论认为，本研究为探索性分析，受限于样本量偏小、未经独立队列与RT-qPCR验证，结果应视为假设生成而非定论。尽管如此，首次在外周血管病患者PBMCs中系统报道了snRNA差异表达谱及候选miRNA–snRNA调控关系，并结合GWAS证据将snRNA遗传变异与血小板功能、血压及吸烟等血管危险因素相联系，为snRNA参与血管稳态失衡与重构提供了线索。snRNAs有望成为外周血管病微创生物标志物及潜在治疗靶点，但其生物学意义与临床转化价值尚需更大规模、平衡设计及机制实验加以确认。

结论（译自原文）：

本研究确定了可能与LEAD和CVD病理生理相关的snRNA表达改变模式及关联的miRNA调控互作。尽管存在局限性，结果凸显了snRNAs作为外周血管疾病中未被充分研究的非编码RNA类别之潜在意义。观察到的失调表明snRNAs可能参与血管功能障碍与重构相关机制，是开发新型诊断生物标志物及潜在治疗靶点的有前景候选分子；但其生物学意义与临床适用性仍有待未来机制与转化研究予以确立。