利用组合生物合成研究细胞松弛素细胞色素P450单加氧酶的多功能性揭示立体化学限制

《Fungal Biology and Biotechnology》：Investigating the versatility of cytochalasan cytochrome P450 monooxygenases using combinatorial biosynthesis reveals stereochemical restrictions

　　

背景细胞松弛素（cytochalasans）是一大类真菌代谢产物，可抑制肌动蛋白聚合，最终在不同检测中产生广泛的生物学效应。对细胞松弛素生物合成的研究表明，细胞色素P450单加氧酶（P450s）修饰酶具有一定程度的松弛底物特异性，并可能接受结构相关的中间体进行氧化，部分解释了该分子家族中观察到的结构变异多样性。在本研究中，研究人员通过组合生物合成研究广泛的P450酶，以更好地了解其底物范围和作为生物催化剂的潜在应用。结果基因组挖掘使研究人员能够在六种不同真菌物种中鉴定出隐秘的细胞松弛素生物合成基因簇（BGCs），每个基因簇至少编码两个P450酶。比较基因组学鉴定出细胞松弛素BGCs中编码的一个隐秘的硫氧还蛋白样酶（thioredoxin-like enzyme），该酶与编码Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）的基因共存。在缺乏pyrichalasin H生物合成所需P450的稻瘟病菌Magnaporthe grisea突变株中异源表达七个P450酶，使三个P450酶（其中两个之前为隐秘的）得以功能表征。实验结果结合P450序列的系统发育分析，揭示了相关细胞松弛素结构的细微信息，并开始解释为何某些P450酶对其可用底物无活性。结论参与细胞松弛素生物合成的P450酶已知在其天然宿主中具有位点选择性，但由于能够修饰结构相关的类似物，也具备固有的混杂性。通过研究来自已表征和隐秘BGCs的一组多样化的P450酶，研究人员发现，当将P450酶引入非天然底物时，细胞松弛素骨架周围官能团的立体化学比大环的大小更具限制性。

**论文解读：利用组合生物合成揭示细胞松弛素细胞色素P450单加氧酶的立体化学限制**

**研究背景与问题**

细胞松弛素（cytochalasans）是一大类真菌天然产物，通过抑制肌动蛋白聚合而表现出广谱生物活性，包括细胞毒、抗微生物、抗病毒和免疫抑制等。其结构核心由聚酮合酶-非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）合成的三环母核构成，随后经多种修饰酶（如细胞色素P450单加氧酶P450s、Baeyer-Villiger单加氧酶BVMO等）进行氧化、环氧化、羟基化等后修饰，产生丰富的结构多样性。尽管已知P450s在天然宿主中具有位点选择性，但部分P450s对结构相关的中间体表现出底物混杂性（substrate promiscuity），这成为解释细胞松弛素家族结构变异的关键。然而，P450s的底物范围、立体化学限制以及作为生物催化剂的潜力尚不明确。此前，研究人员已建立基于稻瘟病菌Magnaporthe grisea突变株的组合生物合成平台，用于研究非天然细胞松弛素P450的功能。本研究旨在拓展该平台，探索来自更广泛真菌物种的P450s，以识别能够氧化修饰非天然细胞松弛素骨架的生物催化剂，并揭示立体化学因素对酶活性的影响。

**研究内容与意义**

研究人员通过基因组挖掘（genome mining）鉴定出六个隐性细胞松弛素生物合成基因簇（BGCs），并利用异源表达、系统发育分析和生物转化等方法，系统评估了来自不同BGCs的P450s的功能。研究发现，P450s的活性受底物大环上甲基的立体化学限制，而非大环大小。这一发现为利用组合生物合成或生物转化策略高效生产新型细胞松弛素提供了理论基础，相关成果发表在《Fungal Biology and Biotechnology》。

**关键技术与方法**

1. **基因组挖掘**：以保守的Diels-Alderase序列（PyiF）为查询序列，在六种商业真菌（包括Aspergillus heteromorphus CBS 117.55、Aspergillus sclerotioniger CBS 115572、Colletotrichum spinosum CBS 515.97、Colletotrichum sidae CBS 518.97、Metarhizium brunneum ARSEF 3297、Metarhizium robertsii ARSEF 23）中鉴定隐性细胞松弛素BGCs，并进行手动注释。
2. **异源表达**：将七个P450基因（包括来自已表征BGCs的CHGG_01243、ccsD、XsCYP2，以及来自隐性BGCs的AhCYP2、CspCYP1、CspCYP2、MrCYP1）分别在M. grisea ΔpyiD或ΔpyiG突变株中异源表达，通过LC-MS分析代谢产物变化以评估P450功能。
3. **系统发育分析**：构建P450序列的系统发育树，结合底物结构特征（大环大小、甲基数量与立体化学）分析P450s的进化关系与底物选择性。
4. **生物转化**：从M. grisea ΔpyiG中纯化中间体7-deshydroxypyrichalasin H，外源脉冲饲喂至M. grisea ΔpyiD菌株，通过LC-MS检测产物恢复情况，验证生物转化可行性。

**研究结果**

**基因组挖掘识别隐性细胞松弛素BGCs、高度保守的硫氧还蛋白样基因，并发现Aspergillus heteromorphus CBS 117.55中假设的细胞松弛素**
研究人员通过基因组挖掘，在六种真菌中鉴定出六个隐性BGCs（命名为ahe、asc、csp、csi、mbr、mro），每个BGC均编码四个核心酶（PKS-NRPS、trans-ER、HYD、DA）及两个P450。此外，所有BGCs均含有一个编码硫氧还蛋白样酶（TRX）的基因，该基因与编码BVMO的基因共定位。通过RT-PCR和HR-LCMS/MS分析，在A. heteromorphus培养物中检测到一个低丰度的假设细胞松弛素（m/z 496.2291，分子式C₂₈H₃₄NO₇⁺），其保留时间与cytochalasin E标准品不同（8.60 min vs. 9.65 min），推测为C18聚酮链且缺乏C-16和C-18甲基的细胞松弛素。

**P450系统发育分析揭示细胞松弛素结构信息**
基于序列比对和系统发育分析，P450s根据其区域化学（环己烯氧化vs.大环氧化）形成不同分支。大环相关P450s的亚分支进一步反映了聚酮链长度、氨基酸类型以及甲基修饰的存在与否。例如，与C16聚酮链相关的P450s形成独立亚支，而与C18聚酮链相关的P450s则聚为另一亚支。

**已表征和隐性细胞松弛素BGCs中大环P450的异源表达**
在M. grisea ΔpyiD（缺乏C-18羟基化P450 PyiD）中异源表达已知迭代羟基化酶CHGG_01243（来自Chaetomium globosum），成功恢复pyrichalasin H产生（8/11转化子），但未观察到双羟基化产物。表达ccsD（来自A. clavatus）和XsCYP2（来自Xylaria sp. X802）均未恢复pyrichalasin H或产生新代谢物；RT-PCR确认基因转录，但ccsD存在内含子剪接异常，而XsCYP2转录正确却无活性。表达来自A. heteromorphus的AhCYP2成功恢复pyrichalasin H产生（3/6转化子），证实其功能及大环P450定位。表达CspCYP1（来自C. spinosum）和MrCYP1（来自M. robertsii）均无效，而CspCYP2（环己烯相关P450）在M. grisea ΔpyiG中成功恢复pyrichalasin H产生，验证其环己烯氧化功能。

**生物转化作为细胞松弛素功能化的替代方法**
研究人员从M. grisea ΔpyiG中纯化7-deshydroxypyrichalasin H（5 mg），脉冲饲喂至M. grisea ΔpyiD菌株。LC-MS分析显示pyrichalasin H产生恢复，证明外源饲喂的细胞松弛素可穿透细胞壁并被内源酶生物转化。

**讨论与结论**

研究人员总结指出，细胞松弛素P450s虽具底物混杂性，但受大环上甲基立体化学的显著限制：pyrichalasin H中C-16和C-18甲基为顺式关系，而19,20-epoxycytochalasin D和cytochalasin E中为反式关系，后者对应的P450（XsCYP2和CcsD）在异源体系中失活；而chactoglobosin A和A. heteromorphus假设细胞松弛素在氧化位点附近缺乏甲基，其对应P450（CHGG_01243和AhCYP2）则具活性。因此，大环的尺寸影响较小，但甲基的立体配置是关键限制因素。此外，PKS-NRPS引入的甲基数量、位置和立体化学变化（385种细胞松弛素统计分析显示57%为C16聚酮链，40%为C18聚酮链）可能不仅影响P450活性，也决定生物活性。AlphaFold模型进一步识别了功能P450中保守的残基（如F154、F438、Q454等），为未来突变研究奠定基础。结论强调，通过正确配对底物与P450酶，可提高新型细胞松弛素的生成效率，并最终拓展其应用潜力。

**研究结论**
参与细胞松弛素生物合成的P450酶已知在其天然宿主中具有位点选择性，但由于能够修饰结构相关的类似物，也具备固有的混杂性。通过研究来自已表征和隐秘BGCs的一组多样化的P450酶，研究人员发现，当将P450酶引入非天然底物时，细胞松弛素骨架周围官能团的立体化学比大环的大小更具限制性。