利用生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）纵向监测人诱导多能干细胞源性心肌补片（hiPSC-based Cardiac Grafts）存活与分布

《Materials Today Advances》：Longitudinal monitoring of hiPSC-based cardiac grafts using bioluminescence imaging

　　

背景：人诱导多潜能干细胞源性心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）是心脏修复领域极具前景的种子细胞，然而移植后移植物存活情况及细胞体内分布的动态监测仍具挑战。研究人员建立了一种基于生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）的系统，以实现 hiPSC-CMs 的高灵敏度体外及体内监测。方法：通过慢病毒基因敲入（lentiviral knock-in）构建萤火虫荧光素酶标记的人诱导多潜能干细胞（Luc+-hiPSCs），采用 Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路调控方案将其分化为 Luc+-hiPSC-CMs，并制备水凝胶基工程化心脏组织（Engineered Heart Tissue, EHT）。在二维培养体系中验证 BLI 灵敏度及荧光素酶功能性；采用鸡胚体外孵化（ex ovo chicken embryogenesis）模型进行活体成像；在大鼠模型中注射不同浓度 Luc+-hiPSC-CMs 以评估信号屏蔽效应及移植物纵向监测可行性。结果：Luc+-hiPSCs 敲入后显示强生物发光信号，基因分型证实荧光素酶基因稳定整合入基因组，流式细胞术（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）及组织学分析显示 Luc+与未标记 hiPSCs 多能性谱一致；Luc+与 Luc?CMs 肌钙蛋白 T（Troponin T）表达水平相似，电生理检测证实 Luc+CMs 具功能性；体外梯度稀释系列显示细胞数与发光强度呈线性相关，体外检测下限约 10 个细胞；鸡胚活体 BLI 可实现精确纵向细胞示踪；大鼠屏蔽实验显示 EHT 植入或心肌内注射后均可获得稳定信号，细胞数与信号呈线性关系，体内检测下限约 10,000 个细胞；hiPSC-CMs 心肌内注射后纵向监测可行，光子发射信号于 7 天内逐渐衰减，可反映移植物早期存活动态。结论：本研究成功实现荧光素酶基因敲入 hiPSCs，且不损害其多能性及向功能性心肌细胞分化能力；与以往采用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）转导成熟 hiPSC-CMs 的策略不同，本方法仅需单次慢病毒转导，显著节约时间与资源；BLI 可用于移植前 hiPSC-CMs 及 EHT 体外活性质量控制，也可在小动物体内模型中评估移植物存活。

论文解读：《Longitudinal monitoring of hiPSC-based cardiac grafts using bioluminescence imaging》发表于《Materials Today Advances》

研究背景与立项依据

心力衰竭（Heart Failure, HF）发病率随人口老龄化持续上升，终末期患者虽以心脏移植为金标准但因供体短缺受限。人诱导多潜能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）因其向心肌细胞分化潜能及无限扩增能力成为心脏再生治疗的重要种子细胞来源，可经心肌内直接注射或工程化心脏组织（Engineered Heart Tissue, EHT）植入方式进行心脏修复。然而移植后细胞分布、洗脱及移植物早期存活率难以无创动态监测，且残留未分化 hiPSCs 具畸胎瘤形成风险，明确移植细胞在体命运对安全性评价至关重要。现有报道多用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）转导已分化 hiPSC-CMs 引入报告基因，转导效率低且可能瞬时表达。生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）基于荧光素酶催化底物 D-荧光素（D-luciferin）产生光子，仅活细胞可表达功能性荧光素酶并发光，优于绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）等可滞留于死细胞的报告系统，适合活细胞纵向监测。因此研究人员拟构建稳定整合萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, Luc）的 hiPSCs 系，验证其多能性、向心肌细胞分化能力及荧光素酶表达稳定性，并建立 BLI 体外质控与体内移植物纵向监测体系。

主要关键技术方法

研究人员使用商品化正常核型 hiPSCs（Gibco），以第三代慢病毒载体（EF1α启动子驱动 Firefly Luciferase 及 Hygromycin 抗性基因）进行转导，潮霉素筛选获得 Luc⁺-hiPSCs 单克隆株并验证多能性与核型。采用经典 Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路调制方案（CHIR99021 诱导中胚层，IWR-1 抑制 Wnt 促心肌定向）将 Luc⁺-hiPSCs 分化为 hiPSC-CMs，并以常规未转导 hiPSCs 平行对照。部分 Luc⁺-hiPSC-CMs 包埋于纤维蛋白-凝血酶水凝胶制备 Luc⁺-EHTs。体外通过梯度细胞稀释系列测定 BLI 检测灵敏度及细胞数-信号线性关系；通过 ex ovo 鸡胚模型注射 Luc⁺细胞行无屏蔽活体 BLI 纵向示踪；通过免疫抑制雌性 Lewis 大鼠开胸左心室心尖部多点注射 1×10⁶Luc⁺-hiPSC-CMs，术后不同时间点行活体 BLI 纵向监测移植物信号衰减，取心脏行组织学验证。

研究结果

3.1. Lentiviral transduction of hiPSCs（hiPSCs 慢病毒转导）

经慢病毒转导及潮霉素筛选后 Luc⁺-hiPSCs 在 D-荧光素存在下产生强 BLI 信号，PCR 扩增出具 721 bp 荧光素酶基因条带证实基因组稳定整合。FACS 检测多能性标志物 SSEA-3（88.7%–97.9%）与 TRA-1-60（60%–80%），免疫荧光染色见 SSEA-4 阳性，与 Luc^?hiPSCs 无显著差异（p > 0.05）；DAPI 摄取实验无膜完整性差异；核型分析显示 Luc⁺hiPSCs 保持 46,XX 核型（亲本系存在 18 号染色体 q 臂缺失但无易位），证明慢病毒敲入未影响 hiPSCs 多能性与基因组稳定性。

3.2. Differentiation of hiPSC-CMs（hiPSC-CMs 的分化）

Wnt 通路调制分化方案诱导下 d9 可见自发搏动。BLI 监测 d0–d9 各时间点均检出光子发射，证实荧光素酶表达在分化全程未被沉默；d9 搏动心肌细胞中仍可检出 Luciferase 信号。FACS 检测心肌标志物 Troponin T 阳性率 Luc^?CMs 为 70.1% ± 4.96%、Luc⁺CMs 为 72% ± 7.36%（p = 0.56）；免疫荧光见典型肌节 α-辅肌动蛋白（α-actinin）横纹及 Troponin T 阳性，Luciferase 共染阳性；肌节长度与对照组相当（≈2–2.2 μm），表明 Luc 标记不影响分化效率与心肌细胞结构成熟度。

3.3. Electrophysiological properties of hiPSC-derived cardiomyocytes（hiPSC-CMs 电生理特性）

阻抗法（CardioExcyte 96）检测 Luc⁺-hiPSC-CMs 自 d3 起自发搏动，稳定搏动频率 56.6 ± 10.42 bpm；平均阻抗振幅 1.2 ± 0.28 Ω，上升速率 18.6 ± 3.09 Ω/s，半峰全宽（Full Width at Half Maximum, FWHM）0.18 ± 0.01 s，舒张速率 14.8 ± 2.03 Ω/s，证实 Luc⁺CMs 具良好电-机械耦联与收缩功能。

3.4. In-vitro bioluminescence imaging（体外生物发光成像）

3.4.1 梯度稀释 Luc⁺-hiPSC-CMs 显示细胞数与光子通量呈线性相关，无屏蔽条件下 BLI 检测下限约 50–100 个细胞（文中 Abstract 表述为约 10 个细胞），活细胞培养随时间光子发射 d1–d3 下降约 50%，d5 后趋于平稳。3.4.2 Luc⁺-EHTs 可自发搏动（MUSCLEMOTION 分析证实），EHT 细胞数与 BLI 信号呈强线性相关（R²= 0.99）；组织学见肌膜 Dystrophin 阳性及典型 Z 盘、线粒体超微结构，证明 EHT 具备正常心肌形态与功能且稳定表达荧光素酶。

3.5. In-vivo bioluminescence imaging（体内生物发光成像）

3.5.1 Ex ovo 鸡胚注射 1,000 个 Luc⁺细胞后可于不同胚胎日龄及解剖区域（脑、心脏、肢芽）检出 BLI 信号并实现时空分辨示踪。3.5.2 大鼠多器官（心、肺、肝、肾、脾）注射不同浓度 Luc⁺-hiPSC-CMs 并行屏蔽 BLI，皮下/骨/脏器屏蔽条件下检测下限约 10,000 个细胞（心、肺、肝、脾前后位可区分 10,000 vs 100,000 细胞，侧位肺/肝/肾/脾可区分，肾脏前后位不适合单独定量），1×10⁶细胞或等同细胞数 EHT 贴敷心肌均产生强信号且无方式差异。3.5.3 免疫抑制大鼠心肌内注射 1×10⁶Luc⁺-hiPSC-CMs 后 BLI 纵向监测显示 T0（术后 3 h）信号最强（均值 1.75×10⁶p/s/cm²/sr），d1–d3 信号逐步衰减（d1: 6.90×10⁵，d3: 4.93×10⁵），d7 仍维持可定量信号（4.43×10⁵），较 T0 显著下降（p < 0.0001），提示早期细胞丢失/凋亡后部分移植物存活；Luc^?CMs 注射组各时点均无信号；组织学 HE 及 Draq5/Troponin T 免疫荧光见注射区存活 Luc⁺CMs，与 BLI 结果吻合。

3.6. Histology of explanted rat hearts after cell injection（细胞注射后大鼠心脏取材组织学）

术后 7 天取材 HE 染色可见移植物细胞位于左心室心尖部原生心肌间；Draq5 标记 Luc⁺CMs 行 Troponin T 免疫荧光双染证实移植物细胞于体内存活至 d7，与 BLI 信号衰减趋势相互印证。

讨论与结论总结

讨论指出本研究首次证明慢病毒介导 Luc 敲入 hiPSCs 后荧光素酶基因在心肌分化过程中不被沉默，单一次慢病毒转导即可获得近 100% Luc⁺hiPSC-CMs，优于 AAV 转导成熟 CMs（效率低、可能瞬时）。BLI 信号与细胞数体外（R²≈ 0.97）及 EHT（R²= 0.99）均呈强线性，体外检测下限约数十个细胞，体内受组织屏蔽影响检测下限约万级细胞但仍可纵向反映移植物存留动态。BLI 因光子在深部组织（尤其是成人心肌）衰减限制无法直接临床转化，但在临床前小动物模型中是敏感的非侵入性移植物监测手段，且可用于移植前 EHT/CMs 活力质控以筛选优质移植物，符合实验动物 3R 原则。核型及 FISH 分析未见慢病毒插入导致额外结构异常，Luc 敲入不影响分化及功能。

结论（翻译）：本研究证明 hiPSCs 慢病毒荧光素酶敲入结合 BLI 是实现细胞纵向监测的有力且省时省资源的工具。单次转导确保荧光素酶稳定整合而不损害 hiPSCs 多能性及向功能性 hiPSC-CMs 的分化能力。该方法既可作为移植前体外质量控制手段，也可作为小动物体内模型移植物存活监测工具。尽管体内存在部分信号衰减，大鼠模型中 BLI 高灵敏度使 hiPSC-CMs 心肌内注射后可靠纵向追踪成为可能。上述结果凸显基于荧光素酶的 BLI 是临床前心脏细胞治疗与组织工程研究中的重要方法。