《Journal of Oral Microbiology》：The effect of probiotic bacteria on community composition, microscale pH and matrix architecture in a saliva-derived model of oral biofilm
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摘要
背景：唾液链球菌（Streptococcus salivarius）K12和M18株作为防龋益生菌近来受到关注。本研究以具氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DSM17938处理组及未处理对照组为参照，在复杂唾液来源体外（i
摘要
背景：唾液链球菌（Streptococcus salivarius）K12和M18株作为防龋益生菌近来受到关注。本研究以具氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DSM17938处理组及未处理对照组为参照，在复杂唾液来源体外（in vitro）模型中探讨补充S. salivarius K12和M18对生物膜毒力的影响。
方法：在低蔗糖（0.05%）和高蔗糖（1%）条件下培养生物膜，分别补充S. salivarius K12、S. salivarius M18或L. reuteri。采用共聚焦显微镜结合pH比值荧光测定法（pH ratiometry）评估微尺度pH动态；通过葡聚糖（glucan）及胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）成像分析生物膜基质（biofilm matrix）组成；采用细菌16S rRNA基因扩增子测序确定微生物群落组成。
结果：0.05%蔗糖条件下，S. salivarius M18组生物膜pH显著高于对照组，S. salivarius K12组无显著差异；L. reuteri组生物膜pH显著降低。1%蔗糖条件下，益生菌补充对生物膜pH无显著影响。菌群组成偏移轻微，最显著表现为1%蔗糖时L. reuteri处理组乳杆菌（Lactobacillus）丰度升高，其余处理组无显著菌群改变。生物膜基质组成（葡聚糖及eDNA）未见显著变化。
结论：综上所述，益生菌补充仅对生物膜组成及毒力产生轻微影响。
论文解读：《The effect of probiotic bacteria on community composition, microscale pH and matrix architecture in a saliva-derived model of oral biofilm》——发表于《Journal of Oral Microbiology》
研究背景与立项依据
益生菌作为龋齿辅助防控策略，早期多采用胃肠道来源的乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium），但其口腔定植能力差，长期生态影响有限。口腔天然共生菌唾液链球菌（Streptococcus salivarius）K12和M18株可产生细菌素（bacteriocin）、脲酶（urease）及葡聚糖酶（dextranase），理论上可抑制致龋菌并降低生物膜酸度，但已有临床试验结果不一致，且缺乏其对牙菌斑（dental plaque）微尺度pH、菌群结构及胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质影响的实验室证据。因此，研究人员采用含混合唾液接种的复杂体外生物膜模型，比较S. salivarius K12、M18与L. reuteri DSM17938处理对生物膜生态及毒力相关参数的影响，以明确其实际作用。
主要关键技术方法
研究人员收集健康志愿者混合刺激性全唾液（pooled stimulated whole saliva）作为接种物及培养基组分，在96孔板中厌氧培养72 h唾液来源多菌种生物膜，设0.05%与1%（w/v）蔗糖条件，于24 h和48 h分别补充调整至1×107CFU/mL的S. salivarius K12、S. salivarius M18或L. reuteri DSM17938悬液（对照组加无菌生理盐水）。主要检测技术包括：①细菌16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台，DADA2推断ASV，SILVA数据库注释，Decontam去污染，ANCOM?BC差异丰度分析，PERMANOVA）；②共聚焦显微镜结合比率荧光探针C?SNARF?4进行蔗糖挑战后微尺度pH比值测定（pH ratiometry），线性混合效应模型统计分析；③培养基中添加Alexa Fluor 647标记葡聚糖及TOTO?1/ SYTO系列核酸染料，共聚焦成像后经DAIME软件分割量化葡聚糖与胞外DNA（eDNA）基质生物体积；④生物膜厚度Kruskal?Wallis检验。
研究结果
Biofilm formation（生物膜形成）
三组益生菌补充组与对照组在0.05%及1%蔗糖条件下的平均生物膜厚度（31.6 ± 6.5 μm）无显著差异（p＝0.74及p＝0.46），说明添加益生菌不影响生物膜基本生长量。
Biofilm composition（生物膜菌群组成）
1%蔗糖组以链球菌属（Streptococcus，69.1±16.1%）和乳杆菌属（Lactobacillus，23.4±19.7%）为主；0.05%蔗糖组群落更多样，含韦荣球菌属（Veillonella）、梭杆菌属（Fusobacterium）等。PERMANOVA显示1%蔗糖时整体组成处理组间有差异（p＝0.001），主要源于L. reuteri组乳杆菌丰度升高（54.8±11.3% vs 对照9.7±0.9%）、链球菌降低（43.6±10.2% vs 对照79.7±0.9%），但两两比较未达显著；0.05%蔗糖时处理组间无组成差异（p＝0.89）。ASV分析确认S. salivarius M18对应的ASV_47仅存在于M18处理组（低相对丰度），L. reuteri对应ASVs仅存在于L. reuteri处理组，提示两株可短暂定植模型生物膜，S. salivarius K12未在测序中检出。
Biofilm pH（生物膜pH）
0.05%蔗糖下，各处理组pH总体有差异（p＜0.001）：L. reuteri组pH显著低于对照组（t2: p＜0.0001），S. salivarius M18组pH显著高于对照组（t2: p＝0.006），S. salivarius K12组与对照组无差异（t2: p＝0.88）。1%蔗糖下各处理组间pH无显著差异（t2: p＝0.81）。提示仅在低糖条件下S. salivarius M18可微弱提升生物膜局部pH。
Biofilm matrix composition（生物膜基质组成）
蔗糖浓度及益生菌处理均不显著影响eDNA生物体积（p＝0.42）及葡聚糖生物体积（p＝0.90），二者与处理×蔗糖交互作用亦不显著。1%蔗糖组整体葡聚糖产量高于0.05%蔗糖组（p＝0.013），符合预期。L. reuteri组葡聚糖呈非显著性降低趋势。说明三种益生菌均未明显改变EPS基质中葡聚糖及eDNA的含量与分布。
讨论与结论总结
研究人员指出，S. salivarius K12和M18对复杂唾液生物膜的总体菌群结构、EPS基质组成影响甚微；仅在低蔗糖条件下S. salivarius M18轻微升高微尺度pH，推测与其脲酶活性产氨有关，但该体外发现的临床意义尚待验证。相比之下，L. reuteri可在高糖条件下大量定植并改变群落向乳杆菌偏移，且在低糖时使局部pH更低，对其作为防龋益生菌的适宜性提出质疑。研究局限性包括体外模型缺乏唾液流动与机械剪切、益生菌持续而非脉冲式添加、培养周期短等，外推至临床需谨慎。
原文结论翻译：综上所述，研究人员证实在复杂唾液来源牙菌斑生物膜模型中，补充益生菌S. salivarius K12和M18对生物膜组成及毒力仅产生轻微影响。在低蔗糖条件下，S. salivarius M18处理组的生物膜pH较其他组显著升高。
