表达CXCL13的CD4+T细胞协调淋巴细胞三元结构促进非小细胞肺癌(NSCLC)抗肿瘤免疫

《OncoImmunology》：CXCL13-expressing CD4+ T cells coordinate the lymphocytes triad to promote the anti-tumor immunity in NSCLC

　　

CD4+T细胞是CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫所不可或缺的，而CD4+T细胞如何与其他细胞协调以促进CD8+T细胞活性尚不清楚。本研究联合单细胞RNA测序(scRNA-seq，single-cell RNA sequencing)与多重免疫组织化学染色(mIHC，multiplex immunohistochemistry)发现，表达CXCL13的CD4+T细胞亚群可招募CXCR5+B细胞形成CXCL13+CD4+T细胞::CXCR5+B细胞::CD8+T细胞三元结构(lymphocytes triad)，促进抗肿瘤免疫并预示良好预后。研究人员鉴定出一个表达CXCL13的CD4+T细胞亚群与较好预后及肿瘤反应性(tumor-reactive)特征相关；进一步的细胞互作分析揭示该亚群与CXCR5+B细胞之间存在特异性CXCL13–CXCR5相互作用，不同于其他细胞类型。mIHC验证CXCL13+CD4+T细胞邻近区域CXCR5+B细胞浸润水平升高。随后采用表征多于两种细胞类型共定位的熵(Entropy)分析揭示空间分布模式，结果表明CXCL13+CD4+T细胞与CXCR5+B细胞共同定位于细胞毒性CD8+T细胞周围，形成功能性淋巴细胞三元结构，其存在预示较好预后。综上，通过整合scRNA-seq与mIHC，研究人员证实新生抗原反应性的CXCL13+CD4+T细胞通过CXCL13–CXCR5信号轴招募CXCR5+B细胞参与三元结构形成，增强非小细胞肺癌(NSCLC，non-small-cell lung cancer)中抗肿瘤免疫并提示良好预后。

论文解读：表达CXCL13的CD4⁺T细胞协调淋巴细胞三元结构促进非小细胞肺癌抗肿瘤免疫

研究背景与立题依据

CD8⁺T细胞是直接杀伤肿瘤的关键效应细胞，而CD4⁺T细胞被认为对CD8⁺T细胞的启动、活化和维持至关重要。尽管已有研究证实肿瘤内CD4⁺T细胞具有抗肿瘤潜能且可表征肿瘤反应性分子特征，但非小细胞肺癌(NSCLC，non-small-cell lung cancer)微环境(TME，tumor microenvironment)中肿瘤反应性CD4⁺T细胞如何释放CD8⁺T细胞的杀瘤活性机制仍不清楚。此外，CD4⁺T细胞可通过分泌细胞因子重塑免疫组分的空间分布并形成三级淋巴结构(TLS，tertiary lymphoid structures)，但其与B细胞及CD8⁺T细胞的具体空间协作关系在NSCLC中尚未阐明。因此研究人员开展此项研究，旨在明确NSCLC中CXCL13表达CD4⁺T细胞亚群的肿瘤反应性特征、细胞互作关系及其与B细胞和CD8⁺T细胞形成的空间功能单元对抗肿瘤免疫及患者预后的影响。论文发表于《OncoImmunology》。

主要关键技术方法

研究人员使用公开scRNA-seq数据集GSE144945（10例NSCLC患者CD45⁺免疫细胞）及GSE131907（11例肺腺癌原发灶）进行细胞分群与验证；从TCGA数据库下载526例肺腺癌(LUAD，lung adenocarcinoma)和501例肺鳞癌(LUSC，lung squamous cell carcinoma)患者RNA-seq及临床随访资料；收集上海交通大学医学院附属瑞金医院82例NSCLC（LUAD）石蜡包埋(FFPE，formalin-fixed paraffin-embedded)组织芯片(TMA，tissue microarray)。技术方法包括：单细胞RNA测序数据分析（质控、Harmony去除批次效应、UMAP降维聚类、肿瘤反应性评分NeoTCR-40、CellChat细胞通讯分析）；多重免疫组织化学(mIHC)七标染色（DAPI、PanCK、CD8、CD4、CD20、CXCL13、CXCR5）及APTIME软件表型识别；基于SPIAT工具包的熵(Entropy)算法计算CXCL13⁺CD4⁺T细胞、CXCR5⁺B细胞与CD8⁺T细胞三元结构共定位"prevalence"（熵值＞0.75网格占比）；Transwell迁移实验验证CXCL13–CXCR5轴介导B细胞招募；ESTIMATE与EPIC算法评估免疫浸润；Kaplan–Meier生存分析与多因素Cox回归评估预后价值。

研究结果

Infiltration of tumor reactive CXCL13⁺CD4⁺T cells heralds a favorable outcome（肿瘤反应性CXCL13⁺CD4⁺T细胞浸润预示良好预后）

研究人员对NSCLC肿瘤内CD4⁺T细胞进行scRNA-seq分群得到CD4_CXCL13、CD4_CCL5、CD4_IL7R和CD4_CCR7四个亚群。CD4_CXCL13亚群高表达CXCL13、TOX、BATF、TIGIT及肿瘤反应性特征基因(NeoTCR-40评分最高)。mIHC显示CXCL13⁺CD4⁺T细胞主要富集于肿瘤组织而非癌旁正常组织；高密度CXCL13⁺CD4⁺T细胞患者总生存期(OS，overall survival)显著延长，TCGA LUAD和LUSC队列中CXCL13/CD4表达比值高组预后更好，且为多因素Cox回归中的独立保护因素。

CXCL13⁺CD4⁺T cells promote the anti-tumor immunity indirectly（CXCL13⁺CD4⁺T细胞间接促进抗肿瘤免疫）

GO富集显示CXCL13⁺CD4⁺T细胞上调T细胞活化与白细胞黏附通路，高表达TNFRSF18(CD27)、CD82、TNFRSF4(OX40)及Tfh样分子IL-21、CD40LG，但低表达穿孔素(PRF1)和颗粒酶B(GZMB)，无明显直接细胞毒性。空间分布上CXCL13⁺CD4⁺T细胞多位于肿瘤边界外，不同于浸润瘤巢的CD8⁺T细胞；CXCL13⁺CD4⁺T细胞高密度组CD8⁺T细胞毒性评分(ssGSEA)显著升高，表明其通过促进CD8⁺T细胞功能而非直接杀瘤发挥抗肿瘤作用。

CXCL13⁺CD4⁺T cells are associated with the infiltration of B cells and CD8⁺T cells（CXCL13⁺CD4⁺T细胞与B细胞及CD8⁺T细胞浸润相关）

基于TCGA EPIC算法估算，归一化CXCL13表达与B细胞相关性最强，与CD8⁺T细胞亦呈正相关，与基质细胞无相关。mIHC定量证实CXCL13⁺CD4⁺T细胞密度与B细胞密度(r=0.6362)、CD8⁺T细胞密度(r=0.4524)均呈显著正相关。

CXCL13⁺CD4⁺T cells recruit B cells through CXCL13–CXCR5 axis（CXCL13⁺CD4⁺T细胞通过CXCL13–CXCR5轴招募B细胞）

mIHC显示CXCR5主要表达于B细胞（尤其记忆B细胞），CellChat分析证实CXCL13⁺CD4⁺T细胞与B细胞间存在特异性CXCL13–CXCR5配体受体互作。距CXCL13⁺CD4⁺T细胞10 μm内CXCR5⁺B细胞数显著多于CXCR5^?B细胞。Transwell实验显示经抗CD3/CD28刺激后PBMC中B细胞向下室迁移增加，加入抗CXCL13或抗CXCR5中和抗体可阻断该招募效应。

Triad among CXCL13⁺CD4⁺T cells, CXCR5⁺B cells, and CD8⁺T cells promotes the NSCLC patients prognosis（CXCL13⁺CD4⁺T细胞、CXCR5⁺B细胞与CD8⁺T细胞三元结构促进NSCLC患者预后）

熵分析显示组织中存在CXCL13⁺CD4⁺T细胞::CXCR5⁺B细胞::CD8⁺T细胞三元结构高prevalence（共定位网格比例高）的患者OS显著延长。多因素Cox回归表明仅三元结构prevalence为保护性因素(HR=0.235, p=0.032)，单一细胞密度不足以独立预测良好预后，强调空间协同的重要性。CellChat还发现CXCL13⁺CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞间存在CXCL13–CXCR3互作及CD80–CD28、HLA相关抗原提呈信号。

CXCL13⁺CD4⁺T cells are associated with TLS-like structure（CXCL13⁺CD4⁺T细胞与TLS样结构相关）

高三元结构prevalence组TLS计数更多，CXCL13⁺CD4⁺T细胞定位于TLS样结构中。TCGA中高TLS特征签名组CXCL13/CD4比值更高，且与TLS成熟度标记CR2(CD21)、FCER2(CD23)正相关，与外周淋巴结地址素(CD34、DACAM1、GLYCAM1)弱相关，提示该三元结构可能是原始滤泡样TLS的功能单元或成熟TLS的组成部分。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究通过空间算法首次在NSCLC中鉴定出CXCL13分泌型CD4⁺T细胞通过CXCL13–CXCR5轴招募CXCR5⁺B细胞并与细胞毒性CD8⁺T细胞共定位形成功能性三元结构，且该结构关联TLS并预示良好预后。区别于以往报道的CD4⁺::CD8⁺::树突状细胞三元结构，本研究证明B细胞亦可参与促进CD8⁺T细胞功能的免疫三元结构，体现细胞免疫与体液免疫的串扰(crosstalk)。CXCL13⁺CD4⁺T细胞具肿瘤抗原反应性但缺乏直接溶瘤毒性，通过空间重塑协调淋巴细胞浸润发挥间接抗肿瘤作用。

结论（翻译自Conclusions）

综上所述，通过对公共数据库scRNA-seq数据的挖掘，研究人员发现一个表达CXCL13的特异性CD4⁺T细胞亚群具有强新生抗原反应功能，并通过CXCL13–CXCR5信号招募B细胞。mIHC进一步验证CXCL13⁺CD4⁺T细胞高浸润患者预后更佳。CXCL13⁺CD4⁺T细胞浸润与TME中CD8⁺T细胞及B细胞浸润相关，且可通过CXCL13–CXCR5轴招募B细胞。空间分析揭示CXCL13⁺CD4⁺T细胞::CXCR5⁺B细胞::CD8⁺T细胞三元结构的形成及其与良好预后的关联。此外CXCL13⁺CD4⁺T细胞浸润还与TLS形成相关，提示该三元结构可能代表TLS的早期或未成熟形式。总之，肿瘤特异性CXCL13⁺CD4⁺T细胞可与CD8⁺T细胞及B细胞形成三元结构以发挥持久抗肿瘤免疫反应；该三元结构的鉴定为NSCLC抗肿瘤免疫的空间调控机制提供新见解，并可辅助患者预后评估。