Substitute CD4+细胞耗竭加速树突状细胞迁移并增强肿瘤引流淋巴结中驻留树突状细胞的增殖

《OncoImmunology》：CD4+ cell depletion accelerates dendritic cell migration and enhances resident dendritic cell proliferation in tumor-draining lymph nodes

　　

CD4+细胞在抗肿瘤免疫应答中的耗竭可促进肿瘤消退并加速肿瘤引流淋巴结（dLNs）中肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的增殖。然而，CD4+细胞耗竭对抗原呈递的跨器官动力学以及树突状细胞（DCs）定性变化的影响尚不清楚。本研究中，研究人员建立了通过KikGR/Fucci小鼠同时检测体内细胞运动和细胞周期阶段的新方法，并利用该方法检测了CD4+细胞耗竭后迁移性DC和淋巴结驻留DC（LNDC）的动态变化。研究人员发现，CD4+细胞耗竭增强了CD11c+ MHC class II^high迁移性DC从肿瘤向dLNs的迁移，并诱导了激活相关的表型变化，如MHC class II表达增加。尽管肿瘤dLNs中总体细胞数减少，LNDC数量却相对维持。在LNDC亚群中，CD4耗竭增加了CD8α⁺CD11b⁺亚群的相对丰度，并促进了新招募LNDC的流入和细胞周期活性。公共单细胞RNA测序数据进一步描绘了肿瘤dLNs内的配体-受体表达关系，包括Flt3l–Flt3和Csf2–Csf2ra/Csf2rb轴。这些发现揭示了CD4+细胞耗竭背景下肿瘤dLNs中DC迁移、激活和LNDC更新的重塑，从而增强了抗肿瘤免疫。

抗肿瘤免疫治疗如免疫检查点抑制剂已在部分晚期和转移性肿瘤患者中取得显著疗效，但如何进一步激活抗肿瘤免疫应答仍是当前研究的重点方向之一。既往研究表明，单克隆抗体介导的CD4+细胞耗竭可抑制小鼠肿瘤生长，并伴随肿瘤引流淋巴结（dLNs）中抗原特异性CD8+ T细胞增殖增强及肿瘤内PD-1⁺ CD8+ T细胞募集增加，且抗CD4单克隆抗体（mAb）处理可诱导肿瘤、dLNs和外周血中CD8+ T细胞受体（TCR）库扩增。临床试验也证实抗CD4抗体IT-1208可导致癌症患者外周血CD4+和CD8+ T细胞克隆更替。此外，抗CD4与抗PD-L1联合治疗可扩增dLNs和肿瘤中肿瘤反应性CD8+ T细胞TCR库，而这一效应可被迁移性DCs的清除所逆转，提示肿瘤抗原携带DCs在驱动肿瘤反应性CD8+ T细胞应答中发挥关键作用。然而，CD4+细胞耗竭后DC亚群及其在肿瘤-dLNs中动态变化的具体机制尚不明确。已知的CD8+ T细胞在淋巴结（LNs）中的激活途径主要包括两条：一是由交叉呈递迁移性传统DC1（cDC1s）介导的直接呈递途径，二是淋巴结驻留DCs（LNDCs）从迁移性DC获取肿瘤抗原后呈递给CD8+ T细胞的间接呈递途径。值得注意的是，DC分裂产生的子代DC可呈递亲代DC捕获的抗原，从而延长抗原呈递时间，提示dLN中DC增殖对增强抗肿瘤免疫应答具有重要意义。鉴于cDC1 LNDCs较cDC2 LNDCs具有更强的诱导抗肿瘤CD8+ T细胞能力，深入理解肿瘤与dLNs之间DC迁移及dLNs内DC更新机制对于优化抗肿瘤免疫治疗策略至关重要。前期研究已发现免疫原性肿瘤细胞死亡可促进迁移性DC从肿瘤向dLNs的迁移，但LNDCs在抗肿瘤免疫应答中的动态变化尚待阐明。因此，研究人员构建了同时表达光转换荧光蛋白Kikume Green-Red（KikGR）和荧光泛素化细胞周期指示剂（Fucci）的双报告基因小鼠系，建立了可在体同步检测细胞运动和细胞周期阶段的新方法（KikGR/Fucci系统），以期系统揭示CD4+细胞耗竭后迁移性DC和LNDC的动态变化规律。

在本研究中，研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用KikGR/Fucci双报告基因小鼠，结合光谱流式细胞术实现四种荧光蛋白的精确区分；建立体内肿瘤或淋巴结光转换追踪模型以标记并追踪迁移性DC及LNDC的来源与去向；运用流式细胞术分析DC亚群表型、数量及细胞周期分布；利用定量实时PCR（qPCR）检测肿瘤dLNs中DC相关生长因子mRNA水平；以及分析公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集以解析肿瘤dLNs中配体-受体的细胞类型特异性表达谱。

研究结果显示：CD4+细胞耗竭增强肿瘤浸润性DC向dLNs的迁移。通过KikGR/Fucci小鼠模型，研究人员发现CD4+细胞耗竭后dLNs中KikGR-Red⁺迁移性DC（CD11c^int MHC class II^high）的数量和比例均显著增加，且这些DC高表达mKO2（G0期标志）而极少有mAG⁺（S/G2/M期）细胞，表明该增加主要源于迁移增强而非增殖。同时，CD4+细胞耗竭还诱导了迁移性DC的激活相关表型变化，表现为MHC class II表达上调，且在迁移性CD11b^–CD103⁺ cDC1和CD11b⁺CD103^– cDC2亚群中均观察到类似现象。

CD4+细胞耗竭增加LNDC数量、激活表型并重塑亚群组成。在肿瘤dLNs总体细胞数减少的背景下，LNDC（CD11c^high MHC class II^int）数量相对维持甚至轻度增加。进一步将LNDC细分为cDC1、CD11b⁺ cDC2、CD8α⁺CD11b⁺和双阴性（DN）四个亚群后发现，CD4+细胞耗竭显著增加了CD8α⁺CD11b⁺ LNDC亚群的相对丰度和绝对数量，并上调了cDC1、cDC2及CD8α⁺CD11b⁺ LNDC亚群中MHC class II的表达水平，提示该处理同时增强了LNDC的数量与激活状态。

CD4+细胞耗竭增强LNDC的流入与增殖。通过光转换dLNs标记驻留DC，研究人员发现CD4+细胞耗竭增加了新招募KikGR-Green⁺ LNDC的比例和数量，同时KikGR-Red⁺（驻留超过24小时）LNDC数量亦有增加趋势。细胞周期分析显示，虽然总体mAG⁺ LNDC比例无显著变化，但新招募KikGR-Green⁺ LNDC中mAG⁺细胞比例显著高于KikGR-Red⁺群体，且CD4+细胞耗竭后mAG⁺ KikGR-Green⁺ LNDC数量显著增加，表明CD4+细胞耗竭促进了新招募LNDC的增殖活性。

CD4+细胞耗竭增强CD8α⁺CD11b⁺ LNDCs和cDC1s的流入与增殖。亚群分析表明，CD4+细胞耗竭增加了所有四个LNDC亚群中KikGR-Green⁺新招募细胞的比例和数量，其中CD8α⁺CD11b⁺和cDC1亚群尤为显著。在KikGR-Green⁺新招募细胞中，CD8α⁺CD11b⁺ LNDCs和cDC1s的mAG⁺细胞比例和数量均显著增加。此外，CD8α⁺CD11b⁺ LNDC亚群中KikGR-Red⁺驻留细胞的mAG⁺数量亦有所增加，提示该亚群具有较其他LNDC亚群更持续的增殖能力。

CD8β⁺细胞耗竭不影响DC迁移和LNDC增殖。为排除细胞死亡相关炎症的非特异性影响，研究人员以CD8β⁺细胞耗竭作为对照。结果显示，尽管CD8⁺ T细胞被有效清除，但迁移性DCs在dLNs中的比例、数量和MHC class II表达均未改变，且四个LNDC亚群的比例、数量、MHC class II表达及mAG⁺细胞比例均无显著差异，表明CD4+细胞耗竭对DC的特异性调控作用并非由广泛的细胞死亡炎症所致。

CD4+细胞耗竭与肿瘤dLNs中Flt3l和Csf2 mRNA表达增加相关。qPCR分析显示，CD4+细胞耗竭后肿瘤dLNs中Flt3l mRNA表达显著增加，Csf2 mRNA水平亦有升高趋势，而CD8β⁺细胞耗竭未引起类似变化。基于公共scRNA-seq数据的分析进一步揭示了肿瘤dLNs内Flt3l–Flt3和Csf2–Csf2ra/Csf2rb配体-受体轴的细胞类型特异性表达模式：Flt3l主要由淋巴结基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞）及部分免疫细胞表达，而Flt3、Csf2ra和Csf2rb则富集表达于DC亚群（包括迁移性DC、cDC1和cDC2），提示CD4+细胞耗竭可能通过改变dLN微环境中的生长因子信号网络来调控DC动态。

讨论部分，研究人员指出，本研究建立的KikGR/Fucci系统成功实现了在体内同步检测细胞运动和细胞周期阶段，揭示了CD4+细胞耗竭对DC迁移、激活和LNDC更新的多重调控作用。肿瘤微环境中免疫抑制性CD4⁺细胞（如Tregs）可通过CTLA-4、LAG3等表面分子及IL-10、TGF-β等细胞因子抑制肿瘤浸润DCs的成熟，而CD4+细胞耗解除了去了这种抑制作用，从而促进迁移性DCs的迁移和成熟。尽管CD4还表达于巨噬细胞、部分单核细胞、DCs和B细胞等，但鉴于T细胞是抗CD4抗体介导耗竭的主要靶细胞，研究人员认为CD4⁺ T细胞（包括Tregs）是主要效应靶点。与单纯Treg清除相比，完全CD4⁺ T细胞耗竭能更显著地抑制肿瘤生长并增强dLNs中cDC1频率和CD86表达，提示其抗肿瘤效应不仅限于Tregs的去除，还涉及其他CD4⁺ T细胞亚群。CD4+细胞耗竭增加的cDC1和CD11b⁺CD8α⁺ LNDCs可通过间接呈递途径增强对CD8⁺ T细胞的抗原呈递。其中，CD8α⁺CD11b⁺ LNDC亚群在肿瘤dLNs中表现出动态丰度和活跃细胞周期进程，且多数表达cDC1相关标志XCR1，提示其可能是一种激活相关的LNDC亚群，但其功能角色尚需进一步研究。Flt3L和GM-CSF是调控LN中DC分化、增殖和稳态的关键生长因子。本研究中，CD4⁺细胞而非CD8⁺ T细胞耗竭与Flt3l和Csf2 mRNA表达增加相关，结合scRNA-seq数据中Flt3l可由基质细胞和免疫细胞广泛产生、而其受体主要表达于DC亚群的结果，提示CD4+细胞耗竭可能通过重塑dLN生长因子微环境来促进DC扩增和激活。然而，CD4⁺ T细胞调控DC迁移和生长因子表达的具体机制仍待阐明。尽管本研究采用PBS对照，但纳入同型对照抗体可能有助于进一步区分CD4+细胞耗竭特异性效应与非特异性抗体介导的免疫调节作用。综上所述，本研究揭示了CD4+细胞耗竭可通过调控迁移性DC和LNDC动力学来增强肿瘤dLNs中的抗肿瘤免疫应答，提示LNDCs在抗肿瘤免疫中的重要性值得进一步深入探究。研究结论为：研究人员通过新型细胞追踪系统证实，抗CD4抗体治疗可促进肿瘤来源迁移性DC向dLNs的迁移和成熟，并促进LNDC亚群的增殖和募集，伴随DC生长因子的诱导产生。然而，CD4⁺ T细胞调控DC迁移和生长因子表达的确切机制仍有待进一步阐明，深入解析这些机制将有助于开发类似CD4耗竭效应的新型治疗策略以促进DC迁移和增殖。