肿瘤驯化巨噬细胞通过细胞因子驱动三阴性乳腺癌肺定植

《OncoImmunology》：Tumor-educated macrophages promote cytokine-driven lung colonization in triple-negative breast cancer

　　

摘要：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）因早期播散和治疗抵抗仍是最致命的乳腺癌亚型之一。本研究揭示了一个以巨噬细胞为中心的细胞因子环路，可促进TNBC转移及免疫逃逸。肿瘤细胞将初始巨噬细胞重编程为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），后者分泌CCL3、CCL4、CXCL2和IL-1β，共同促进上皮—间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）、迁移、跨内皮侵袭及肺定植。这些TAM又可诱导初始CD4+T细胞分化为FOXP3+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），建立自我强化的免疫抑制微环境。分别用maraviroc（CCR5抑制剂）、navarixin（CXCR2抑制剂）和anakinra（IL-1受体拮抗剂）药理抑制CCR5、CXCR2和IL1R1可破坏该细胞因子轴，抑制体内转移性定植。研究结果表明，阻断细胞因子受体信号可干扰巨噬细胞与TNBC细胞间的促转移串扰，为抑制TNBC转移及克服治疗抵抗提供了具临床可行性的策略。

论文解读——《OncoImmunology》发表文章：Tumor-educated macrophages promote cytokine-driven lung colonization in triple-negative breast cancer

一、研究背景与立项依据

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）缺乏雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达，较其他乳腺癌亚型侵袭性更强、转移倾向更高。新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）后未达到病理完全缓解（pathological complete response，pCR）而留有残留病灶（residual disease，RD）的患者预后显著更差。目前对于驱动NAC耐药和转移性复发的生物学程序——特别是肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）中巨噬细胞驱动的细胞因子网络及其对TNBC细胞获得稳定促转移特性的影响——尚未被系统阐明。肿瘤内高巨噬细胞浸润与TNBC不良预后相关，但TNBC细胞与巨噬细胞互作的具体分子性质、功能后果及其对早期转移能力（独立于适应性免疫效应功能）的塑造仍不明确。本研究旨在解析以巨噬细胞为中心的细胞因子串扰在TNBC NAC耐药表型和肺转移定植中的作用及机制，并评估靶向阻断该细胞因子轴的治疗潜力。

二、主要关键技术方法概述

研究人员开展了一项前瞻性TNBC患者队列研究（HULAFE队列，西班牙Hospital Universitari i Politecnic La Fe，2015–2017年入组，基线穿刺活检标本经RNA提取及Clariom S芯片检测，按Miller–Payne分级分为pCR组与poor responder组），并以公共数据集GSE106977验证；采用CIBERSORTx反卷积分析肿瘤浸润免疫细胞组成；建立THP-1单核细胞经PMA诱导为M0巨噬细胞后与TNBC细胞（MDA-MB-468、MDA-MB-231等）无接触双室共培养（two-phase coculture）模型获取肿瘤驯化TAM条件培养基（tumor-associated macrophage-conditioned medium，TAM-CM）；通过细胞因子抗体芯片及ELISA鉴定共培养上清中特异性上调的细胞因子（CCL3、CCL4、CXCL2、IL-1β）；以划痕愈合、Transwell基质胶侵袭及HUVEC跨内皮迁移实验评估TAM-CM对TNBC细胞迁移侵袭的影响；用ddPCR、Western blot及RNA-seq分析共培养前后肿瘤细胞与巨噬细胞的基因/蛋白表达变化（EMT标记物、M1/M2相关标记物）；分离健康供体初始CD4⁺CD25^?T细胞，以TAM-CM或共培养诱导Treg分化并检测FOXP3、IKZF4表达，分析T细胞与巨噬细胞相互强化作用；采用B-NDG免疫缺陷小鼠尾静脉注射TAM-CM预处理的MDA-MB-468-Luc细胞建立肺定植模型，活体生物发光成像（IVIS）监测肺转移负荷，免疫组化检测肺组织人细胞角蛋白8/18（cytokeratin 8/18，CK8/18⁺）及标志物；分别以CCR5抑制剂maraviroc、CXCR1/2抑制剂navarixin、IL-1受体拮抗剂anakinra单独或联合处理体外及体内实验，评估对迁移、EMT及肺定植的抑制效果。

三、研究结果

Immunosuppressive transcriptional programs and macrophage-driven colonization define poor responders in TNBC

对HULAFE队列及GSE106977数据集进行基因集富集分析显示，NAC poor responder肿瘤显著富集调节性T细胞（Treg）活性、炎症免疫抑制性巨噬细胞极化、细胞外基质重塑、EMT、迁移侵袭及细胞因子/趋化因子信号通路。CIBERSORTx推断poor responder活检标本中M2样巨噬细胞比例升高，记忆活化CD4⁺T细胞减少。体外TAM-CM可显著增强TNBC细胞迁移、Matrigel侵袭及HUVEC跨内皮迁移能力；尾静脉注射经TAM-CM"驯化"的MDA-MB-468-Luc细胞较未处理对照产生更强的肺部生物发光信号、更多CK8/18⁺肿瘤细胞及转移结节，证实肿瘤—巨噬细胞可溶性因子教育可赋予TNBC细胞增强的肺定植能力。

In vitro coculture defines the molecular features of immunosuppressive TAMs

TNBC细胞与M0巨噬细胞共培养后，巨噬细胞上调M2相关基因（CD163、IL10、MMP9、VEGFA、PD-L2）及部分M1标记（IL6、HLA-DR），呈混合TAM表型；肿瘤细胞中免疫抑制及间质标志（IL6、PD-L1、CDH2[N-cadherin]、MMP9、TWIST1、VIM[vimentin]）上调。形态学可见肿瘤细胞形成片状伪足/丝状伪足，巨噬细胞呈细长M2样突起。Western blot示TAM中CD163和MMP9升高，共培养肿瘤细胞中vimentin升高、E-cadherin（CDH1）无明显变化。流式细胞术确认CD163⁺及HLA-DR⁺巨噬细胞比例增加。RNA-seq热图显示肿瘤细胞富集免疫抑制与EMT特征，巨噬细胞富集M2样及TAM相关转录谱。

Crosstalk with macrophages induces IL-1β, CCL3, CCL4, and CXCL2 secretion and enhances TNBC migration

细胞因子抗体芯片及ELISA发现CCL3、CCL4、CXCL2和IL-1β仅在TNBC—巨噬细胞共培养条件培养基中显著升高，且主要源于巨噬细胞（ddPCR及RNA-seq验证）。RNA-seq火山图显示TAM中CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2、IL6、VEGFA、IL1R2、CXCL1等趋化因子模块协同上调，界定了该共培养诱导的协调趋化因子分泌程序。

Tumor-associated macrophages promote Treg differentiation and reinforce immunosuppressive crosstalk

初始CD4⁺CD25^?T细胞经TAM-CM处理（非直接接触肿瘤细胞）后FOXP3及IKZF4表达显著升高，表明巨噬细胞源性因子驱动初始T细胞向Treg分化；与肿瘤共培养的T细胞（TATs）本身不诱导Treg但可强化巨噬细胞M2极化——TAT-CM使巨噬细胞进一步上调IL-6、IDO1、PD-L1和PD-L2。仅TAM-CM或经TAT-CM再教育的巨噬细胞条件培养基能促进TNBC迁移，且伴CCL3/CCL4/CXCL2/IL-1β高水平分泌；经典细胞因子极化M2巨噬细胞或iTreg条件培养基促迁移作用弱。转录组特征显示TAM-CM暴露的T细胞富集效应Treg签名。由此构成"肿瘤细胞→TAM极化→Treg分化←→TAT强化巨噬细胞抑制程序"的自我放大免疫抑制环路。

Pharmacological inhibition of cytokine signaling blocks TNBC migration and lung colonization

在TAM-CM刺激的TNBC迁移/侵袭实验中，maraviroc（CCR5拮抗剂）、anakinra（IL-1R1拮抗剂）及navarixin（CXCR2拮抗剂）单独或联用显著降低迁移率与穿膜/跨内皮侵袭能力，其中maraviroc与anakinra抑制作用最强。无细胞毒性浓度下，maraviroc+anakinra部分逆转共培养诱导的巨噬细胞CD163上调（削弱TAM极化），并下调肿瘤细胞CDH2、VIM及MMP9表达。体内实验：尾静脉注射TAM-CM驯化细胞后，接种当周连续5天腹腔给予maraviroc+anakinra或细胞预处理时加入抑制剂，均显著抑制肺部生物发光信号及CK8/18⁺肿瘤细胞数与转移结节密度；IHC示用药组肺组织CD163⁺及vimentin信号减弱。表明阻断CCR5和IL-1R1信号可破坏TAM介导的肿瘤细胞"转移能力获得"及"已获得定植能力的维持"。

四、讨论与结论翻译（浓缩自Discussion）

本研究确定以巨噬细胞为中心的细胞因子环路（TAM分泌IL-1β、CCL3、CCL4、CXCL2→激活TNBC细胞CCR5/CXCR2/IL-1R1→促EMT、迁移及肺定植；TAM-CM诱导初始T细胞→FOXP3⁺Treg；TATs反馈强化巨噬细胞M2/免疫检查点分子表达）是TNBC不良NAC响应及转移定植的关键驱动因素。肿瘤驯化巨噬细胞并非经典M2，而是兼具M1/M2特征的混合TAM表型。预先暴露于TAM-CM可使TNBC细胞获得持续增强的肺定植能力，且该细胞因子轴在转移定植阶段仍活跃——因此阻断此串扰既可预防也可干扰已建立的转移潜能。用已上市药物maraviroc（CCR5 inhibitor）与anakinra（IL-1Ra）靶向此网络可有效抑制体外迁移侵袭及体内肺转移定植，为未来TNBC转移预防策略及与免疫检查点抑制剂联用提供了机制依据与概念框架。受限于免疫缺陷小鼠模型未能评估完整适应性免疫背景下Treg分化对转移的体内贡献，后续需在免疫健全或人源化模型中验证并与抗PD-1/PD-L1疗法联用考察。此外，该巨噬细胞—肿瘤细胞细胞因子互作模式在肺癌、前列腺癌及骨肉瘤细胞系中也有类似表现，提示其潜在广泛适用性。总之，肿瘤驯化巨噬细胞通过分泌IL-1β、CCL3、CCL4和CXCL2驱动TNBC EMT、迁移及肺定植，并建立Treg介导的免疫抑制微环境；药理学阻断CCR5与IL-1R1信号可破坏此促转移串扰，为克服TNBC转移与治疗抵抗提供了具临床转化潜力的干预靶点。