FTL008.16，一种5T4条件性4-1BB双特异性抗体，通过肿瘤导向T细胞激活强效增强抗肿瘤免疫

《OncoImmunology》：FTL008.16, a 5T4-Conditional 4-1BB bispecific antibody, potently enhances antitumor immunity via tumor-directed t-cell activation

　　

4-1BB激动剂用于癌症免疫治疗的临床开发一直受到剂量限制性毒性的制约，尤其是肝毒性（hepatotoxicity）。为克服这一挑战，研究人员开发了FTL008.16，一种靶向T细胞上4-1BB（CD137）和肿瘤相关抗原5T4的新型双特异性抗体（bispecific antibody, BsAb）。FTL008.16是一种人IgG1抗体，其携带效应功能缺陷的Fc区域，能够特异性结合4-1BB上与天然配体（4-1BBL）重叠的表位，潜在模拟生理性4-1BBL介导的共刺激作用。正如体外报告基因实验和原代细胞系统所证明的那样，FTL008.16引发严格依赖于5T4参与的剂量依赖性4-1BB激活，增强T细胞增殖、细胞因子分泌和肿瘤细胞裂解，从而在临床前模型中显示出强效的抗肿瘤疗效。在体内，FTL008.16表现出优于常规抗4-1BB单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的疗效，在CT26和MC38模型中均抑制了已建立肿瘤的生长，其中CT26肿瘤观察到完全消退。在食蟹猴中，FTL008.16显示出极佳的安全性特征，即使在50 mg/kg剂量下也未观察到丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）或天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）的升高。重要的是，这种5T4限制性激活机制将免疫刺激局限于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），从而规避了与传统4-1BB激动剂相关的全身毒性。综上所述，这些发现确立了FTL008.16作为一种条件性活性免疫治疗药物，成功实现了强效的抗肿瘤疗效和良好的安全性特征。

近年来，免疫治疗已成为肿瘤学领域中具有变革性的治疗方式。具体而言，靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)、程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1, PD-1）及其配体PD-L1的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已在多种恶性肿瘤中显示出持久应答。然而，其临床应用仍受制于异质性应答率和免疫相关不良事件。为克服这些局限性，药物开发已转向设计用于肿瘤局部激活的下一代免疫治疗，特别是靶向T细胞共刺激受体4-1BB（CD137）的药物。肿瘤抗原依赖性4-1BB激动作用可选择性激活肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）和自然杀伤（natural killer, NK）细胞，增强其效应功能和存活，同时避免全身毒性。

靶向4-1BB的合理性建立在其强大的生物学特性和限制性激活特征基础之上。作为肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF）成员，4-1BB在活化免疫细胞上表达，其在T细胞受体（T-cell receptor, TCR） engagement后于T细胞和NK细胞上的表达显著上调。4-1BB与其天然配体4-1BBL/TNFSF9的结合触发强大的下游信号传导，为细胞毒性T细胞提供关键的共刺激信号。关键的是，该信号能够驱动肿瘤特异性T细胞的持续性功能改变，且其活性自然局限于抗原和配体同时存在的微环境，如肿瘤和引流淋巴结。这种强效疗效与固有空间限制的结合使4-1BB成为安全有效免疫治疗的理想候选靶点。

4-1BB共刺激在肿瘤学中的治疗潜力已在临床前研究中得到广泛验证。然而，第一代抗4-1BB单克隆抗体如urelumab和utomilumab的临床应用受到全身毒性的限制。具体而言，urelumab引起剂量限制性肝毒性，而utomilumab作为单药治疗疗效有限。为应对这些挑战，研究人员设计了下一代双特异性抗体以实现肿瘤限制性4-1BB激活，通过肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs）的共参与来发挥作用。多种TAA×4-1BB双特异性构建体的临床前评估，包括HER2×4-1BB、CD30×4-1BB和B7H3×4-1BB，已证实增强的肿瘤特异性和降低的脱靶毒性。该策略已推进至I/II期临床试验，采用Fc沉默、条件活性双特异性抗体靶向PD-L1×4-1BB和CLDN18.2×4-1BB，早期结果显示在实体瘤患者中展现出有前景的安全性特征和抗肿瘤活性。

该策略的成功关键在于最佳肿瘤相关抗原的选择。癌胚抗原5T4（trophoblast glycoprotein）是一个理想的候选靶点，因其在正常成人组织中表达极少，但在多种癌瘤中频繁过表达，包括结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和肾细胞癌。5T4的高表达与肿瘤侵袭、转移和患者不良预后密切相关，进一步支持其作为治疗靶点的相关性。重要的是，5T4在肿瘤细胞表面稳定表达且原发灶异质性有限，这是确保肿瘤限制性4-1BB激活有效且一致共参与的关键特征。这一原理因针对5T4的 ongoing 临床项目而得到进一步加强，包括抗体药物偶联物、CAR-T细胞疗法和双特异性抗体，这些项目在早期试验中已显示出良好的安全性特征和初步抗肿瘤活性。

在本研究中，研究人员描述了一种名为FTL008.16的新型双特异性抗体，其由肿瘤靶向人IgG1（hIgG1）臂和两个4-1BB激动性单链可变片段（single-chain variable fragments, scFvs）组成。基于5T4的肿瘤限制性过表达谱选择其作为靶向部分。与内部开发的亲本抗4-1BB单克隆抗体FTL001相比，FTL008.16在体外表现出增强的T细胞共刺激活性和改善的肿瘤定位。机制上，结构分析揭示FTL008.16结合人4-1BB的表位与4-1BBL重叠，竞争性阻断天然配体结合。引入Fc沉默突变以最小化FcγR相互作用，确保严格的5T4依赖性交联以实现双抗原共表达位点的条件性4-1BB激活。FTL008.16以5T4依赖性方式在体内外有效诱导4-1BB信号并放大T细胞应答，同时减轻全身免疫毒性和肝毒性。综上所述，这些发现确立了5T4导向的4-1BB激活作为一种有前景的实体瘤治疗策略，成功将强效抗肿瘤疗效与全身毒性解离开来。

**主要关键技术方法**

样本队列来源方面，研究使用了中国科学院细胞库（上海）的DLD-1和MDA-MB-231人肿瘤细胞系；外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）购自Milecell Biotechnologies，来源于健康供体外周血。主要关键技术包括：表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）技术用于分析抗体与4-1BB及5T4的亲和力及动力学参数；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）用于评估抗体结合竞争性及双特异性结合验证；基于HEK-Blue的报告基因细胞系用于量化4-1BB通路激活和NF-κB信号转导；流式细胞术用于分析细胞结合、4-1BB表达及免疫细胞表型；Western blotting用于检测TRAF2磷酸化等下游信号分子；体外功能实验评估T细胞增殖（CFSE标记）、细胞因子释放（Luminex/ELISA）及靶细胞杀伤（CellTiter-Glo裂解实验）；人源化基因敲入（humanized knock-in, KI）小鼠肿瘤模型（C57BL/6-hCD137和BALB/c-hCD137）用于评估体内抗肿瘤疗效；体内荧光成像技术（IVIS）用于分析抗体生物分布和肿瘤靶向性；以及食蟹猴重复给药毒性研究评估临床前安全性。

**研究结果**

**新型肿瘤靶向4-1BB×5T4双特异性抗体（FTL008.16）的开发**：研究人员首先生成并表征了高亲和力激动性抗人4-1BB单克隆抗体FTL001。结构建模显示FTL001识别4-1BB上与urelumab、utomilumab和4-1BBL不同的表位。竞争性ELISA显示FTL001对4-1BBL具有强效阻断活性，IC₅₀为1.015 μg/mL，优于utomilumab（IC₅₀=6.160 μg/mL），与FTL008.16（IC₅₀=1.249 μg/mL）相当，urelumab仅显示微弱阻断。

接着构建4-1BB×5T4双特异性抗体FTL008.16，将来源于FTL001的抗4-1BB scFv融合到高亲和力抗5T4 IgG1（HB5-2-6克隆；K_D=18.71 pM）的C末端，并引入L234A、L235A和P329G（LALA-PG）突变以消除FcγR结合。ADCC报告基因实验证实FTL008.16未诱导针对5T4阳性CT26h5T4细胞或293Th4-1BB细胞的ADCC活性。SPR分析确认FTL008.16以高亲和力结合人4-1BB（K_D=3.90 nM）和更高亲和力结合人5T4（K_D=24.2 pM），双结合ELISA验证其同时结合两种抗原的双特异性特征。

**FTL008.16结合5T4和4-1BB并诱导强效的抗原依赖性4-1BB激动活性**：通过流式细胞术确认FTL008.16对5T4阳性肿瘤细胞和4-1BB表达细胞的特异性结合后，研究人员使用NF-κB报告系统与5T4阳性肿瘤细胞系共培养评估其介导的4-1BB信号传导。FTL008.16表现出强效的5T4依赖性激动活性，高5T4细胞中的EC₅₀为6.65–8.46 ng/mL，MDA-MB-231细胞中为12.86 ng/mL，DLD-1细胞中为23.10 ng/mL，与细胞5T4表达水平相关。相反，FTL001在所有细胞系中显示弱的5T4非依赖性活性。使用等基因MC38细胞，FTL008.16表现出严格的5T4依赖性，5T4阴性细胞相较于5T4阳性细胞效力降低约50倍（EC₅₀=12,565 vs. wisdom 236.1 ng/mL），而FTL001不受5T4表达影响。

Western blot分析显示，FTL008.16在293Th4-1BB细胞中诱导剂量依赖性的TRAF2磷酸化（pTRAF2）增加，不影响总TRAF2或GAPDH水平。在50 nM和5 nM浓度下，FTL008.16显著增强pTRAF2水平，与FTL001效果相当，证实其特异性激活下游TRAF2信号。

**FTL008.16增强5T4依赖性T细胞应答和体外杀伤**：肿瘤刺激和共培养后，4-1BB表达在CD8⁺ T细胞上最为显著地上调，确定其为4-1BB导向治疗的主要靶细胞群体。FTL008.16对活化T细胞显示浓度依赖性结合，在CD8⁺ T细胞上观察到最高结合水平。在5T4表达CHO细胞存在下，FTL008.16诱导CD3刺激PBMCs中CD8⁺ T细胞的剂量依赖性扩增。与5T4表达CHO细胞共培养时，FTL008.16从PBMCs和纯化T细胞中诱导强效的剂量依赖性IFN-γ产生，且该反应严格依赖于5T4表达。

健康供体PBMCs的炎性细胞因子释放分析显示，FTL008.16在任何测试浓度下均未诱导非特异性促炎细胞因子产生。与之相比，FTL001和FTL008.16均显著增强对5T4阳性DLD-1细胞的PBMC介导的细胞毒性，且呈剂量依赖性；两种抗体对5T4阴性HEK 293T细胞均未诱导显著细胞毒性。

**FTL008.16在人源化小鼠模型中的抗肿瘤疗效**：为评估体内抗肿瘤疗效，研究建立了C57BL/6-hCD137敲入小鼠MC38h5T4肿瘤模型。0.68 mg/kg和1.36微胖F FTL008.16治疗显著抑制肿瘤生长，1.36 mg/kg FTL008.16在实验终点较FTL001（1 mg/kg）显示出统计学上更优的抗肿瘤疗效。在BALB/c-hCD137 KI小鼠CT26h5T4模型中，FTL008.16 0.68、1.36和2.72 mg/kg剂量依赖性抑制肿瘤生长，2.72 mg/kg剂量效果最强，部分动物出现完全消退。所有治疗均良好耐受，无显著体重下降。

体内成像显示FTL008.16较hIgG对照和FTL001表现出显著增强的肿瘤特异性积累，48小时达到峰值信号强度。肿瘤部位强烈局灶的荧光与对照抗体的广泛全身分布形成对比，证实其优越的肿瘤靶向性。

**FTL008.16在食蟹猴中耐受良好且不诱导全身细胞因子释放**：食蟹猴安全性评估中，5、15和50 mg/kg剂量组均良好耐受，无治疗相关不良效应。即使在最高50 mg/kg剂量下，也无肝毒性指征，ALT/AST水平无升高，组织病理学检查未见免疫介导性肝脏炎症。血液学参数无生物学相关改变，所有动物血清细胞因子水平不可检测或低于定量下限。

**讨论总结**

讨论部分首先回顾了4-1BB激动剂临床开发的历史挑战，即剂量限制性肝毒性或次优疗效。研究人员通过开发FTL008.16克服了这一挑战，该双特异性抗体将4-1BB激动作用限制于5T4阳性肿瘤。其设计原理强调安全有效的TNFRSF激动作用依赖于对抗体特性的精确控制，包括亲和力、Fc功能和交联能力。FTL008.16对5T4相对于4-1BB的161倍亲和力偏向（K_D=24.2 pM vs. 3.90 nM）以及LALA-PG Fc沉默突变的引入，使得产能性4-1BB簇集仅在5T4阳性肿瘤微环境中发生，从而避免脱靶毒性。

FTL008.16靶向的4-1BB表位部分与4-1BBL结合位点重叠，这使其与临床阶段前身物根本区别开来。与urelumab（远端表位配体非阻断剂）或utomilumab（空间位阻配体结合抑制剂）不同，FTL008.16兼具配体阻断能力和显著改善的安全性特征。食蟹猴中完全无肝毒性的表现为其宽治疗窗提供了转化价值证据。

功能上，关键发现是FTL008.16效力与靶抗原密度相关。在5T4表达各异的细胞系中，包括工程化高表达模型和内源中等表达模型，其激动活性随5T4水平变化而缩放。严格5T4依赖性通过5T4阴性等基因细胞中约50倍的效力降低得到进一步证实。这种抗原依赖性选择性建立了区别于传统非靶向4-1BB激动剂的广泛安全边际。

机制研究揭示FTL008.16通过Ser11位TRAF2磷酸化激活经典4-1BB通路启动K63连接泛素化级联。这种将精确肿瘤靶向与放大细胞内信号相结合的整合机制，使其避免了urelumab的组成性激动和毒性，同时超越主要依赖定位而无内在信号增强的检查点调节双特异性抗体。

体内验证显示FTL008.16在所有剂量下均未引起体重下降或其他明显毒性迹象，荧光成像证实其在5T4阳性肿瘤中的高效特异性积累。

**研究结论**

研究人员开发了FTL008.16但现在拥有一称新型4-1BB×5T4双特异性抗体，其包含消除FcγR结合的LALA-PG Fc沉默突变，在5T4阳性肿瘤细胞上实现条件性4-1BB激动作用。这种肿瘤选择性机制在临床前模型中驱动强效抗肿瘤疗效，同时成功避免了困扰以往4-1BB靶向疗法的全身免疫激活和肝毒性。这些令人信服的临床前疗效和安全性数据为其临床转化提供了有力依据。据此，已启动I期临床试验（CTR20251519）评估FTL008.16在晚期实体瘤患者中的安全性、药代动力学、药效学和抗肿瘤活性，该试验将批判性评估这种靶向方法能否为癌症患者提供更优的治疗窗。