无标记多光子显微镜（Label-free Multiphoton Microscopy, MPM）用于胶质瘤特征及肿瘤异质性的术中识别

《Frontiers in Oncology》：Label-free multiphoton microscopy for intraoperative identification of glioma features and tumor heterogeneity

　　

摘要（Abstract）：背景：弥漫性胶质瘤（diffuse gliomas）是一组异质性原发脑肿瘤，其生物学行为与侵袭性各异。术中获知肿瘤亚型及级别可指导手术策略调整。目的：探讨能够实现胶质瘤分级的组织原位（in situ）表征、基于无标记多光子成像模式的胶质瘤可视化方法。方法：采用相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS）、自体荧光（Autofluorescence, AF）及二次谐波产生（Second Harmonic Generation, SHG）的多模态成像方法，采集102例胶质瘤患者——包括胶质母细胞瘤（WHO 4级）、星形细胞瘤（WHO 2、3、4级）及少突胶质细胞瘤（WHO 2、3级）——的广泛数据集，基于目视评估各特定组织特征的检出率，构建肿瘤恶性程度评分。结果：CARS可检测脂滴（lipid droplets, LD），AF显示细胞结构，SHG可视化血管及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑；上述特征与肿瘤恶性度相关且可被术者术中辨识。量化分析显示不同肿瘤类型间特征检出率存在统计学显著差异，尤以WHO 2级与WHO 4级胶质瘤间为著，尽管个体间及同一样本内存在较大变异。将多成像特征按有无整合为数值评分后，分值可反映恶性程度，最高分值仅出现于WHO 4级肿瘤。结论：无标记多光子成像具备作为术中诊断工具的较强潜力，可使术者依据易辨识组织特征打分，实时获取胶质瘤恶性程度信息。

论文解读——《Label-free multiphoton microscopy for intraoperative identification of glioma features and tumor heterogeneity》（发表于 Frontiers in Oncology）

一、研究背景与立项依据

成人型弥漫性胶质瘤包括不同恶性级别的星形细胞瘤（astrocytoma）与少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma）以及胶质母细胞瘤（glioblastoma, WHO CNS Grade 4），各亚型组织病理及分子特征不同，生长模式与临床行为迥异。手术切除范围为影响生存期的重要因素，但术中决策需平衡切除范围与功能区保留。目前胶质瘤确切诊断及WHO分级依赖术后组织病理学与分子分析，属回顾性诊断；术者仅能凭肉眼、触感及术前影像推断。若能术中获知亚型与恶性度，可针对性调整切除范围与辅助治疗策略。无标记（label-free）多光子显微镜技术——包括自体荧光（autofluorescence, AF）、二次谐波产生（second harmonic generation, SHG）、相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS）及受激拉曼散射（stimulated Raman scattering, SRS）——可在不施予染色剂或对比剂情况下可视化组织形态与生化组成，既往研究多用于肿瘤/非肿瘤脑组织区分或结合机器学习分类。但数据驱动模型对成像条件、制样及个体差异敏感，且"黑盒"算法可解释性差、监管审批难，临床转化受限。因此，本研究旨在基于稳定、肉眼可辨识的无标记多光子图像特征，建立简单、可解释的评分体系供神经外科医生术中直接判读，以辅助胶质瘤识别与恶性程度评估。

二、主要关键技术方法

研究人员收集102例接受胶质瘤切除术患者的新鲜标本，经液氮冻存、包埋后制作16 μm厚冰冻切片。采用配备W Plan-Apochromat 20×/1.0物镜的多光子显微镜（LSM 7 with Axio Examiner Z.1, Carl Zeiss），以Femto Fiber pro NIR（781 nm）及TNIR（1005 nm）飞秒激光激发，同步采集CARS（检测CH伸缩振动约2850 cm^?1，带通滤光片633–647 nm）、AF（带通滤光片500–550 nm）及SHG（带通滤光片381–399 nm）三通道信号。图像经Fiji软件去条纹、高斯模糊去噪及线性亮度/对比度调整后，由对诊断设盲的人员目视判读各视野（field of view, FoV, 106 μm × 213 μm）内特征（脂滴LD、胞质AF阳性细胞、点状AF、病理性血管、规则血管、ECM胶原沉积等）的有无，计算各特征在某一样本中的视野检出率（prevalence）。统计学分析采用Kruskal-Wallis检验及Dunn's多重比较。基于简化特征（脂滴存在与否、AF细胞及点状AF缺失与否、SHG信号存在与否）构建0～5分术中评分，取各病例多个视野中最高分（score_max）代表该例。

三、研究结果

3.1 Heterogeneity of tissue morphochemistry（组织形态化学的异质性）

研究人员对102例胶质瘤各样本多点（约1 mm×1 mm区域）成像发现，同一测量位点的组织形态化学较均一，但不同位点间及不同患者间差异明显；55/102例样本不同测量位点间存在显著形态化学异质性（胶质母细胞瘤31/53，各亚型均有分布）。CARS可靠显示脂滴（LD）及有髓轴突，AF显示胞质自体荧光细胞、点状AF及钙化，SHG显示血管壁胶原、ECM重塑胶原及淀粉样小体（corpora amylacea）。以上特征在不同WHO级别及亚型中均可出现，但分布与检出率有差异。

3.2 CARS signal（CARS信号——脂滴分析）

研究人员发现胞内脂滴（intracellular LD）见于94/102例，胞外脂滴（extracellular LD）见于83/102例；无脂滴样本多为WHO 2级（少突胶质细胞瘤及星形细胞瘤），仅1例胶质母细胞瘤无胞内LD。脂滴（尤其胞外LD）在低级别胶质瘤视野检出率显著低于高级别；星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤WHO 2级vs星形细胞瘤WHO 4级及vs胶质母细胞瘤差异显著。若检出胞内LD，通常伴同等或更高胞外LD检出率。

3.3 Autofluorescence signal（AF信号——自体荧光细胞分析）

强胞质AF细胞在所有样本（除1例胶质母细胞瘤）中被观察到，但其视野检出率变异大。低检出率（＜10%）主要见于星形细胞瘤WHO 3/4级及胶质母细胞瘤。少突胶质细胞瘤WHO 2/3级及星形细胞瘤WHO 2/3级中位AF细胞检出率高于星形细胞瘤WHO 4级及胶质母细胞瘤，统计差异仅少突胶质细胞瘤WHO 2级vs星形细胞瘤WHO 4级及vs胶质母细胞瘤达显著。钙化伴强AF仅见于2例（1例少突胶质细胞瘤WHO 2级，1例胶质母细胞瘤）。

3.4 SHG signal（SHG信号——血管与ECM分析）

规则血管（regular vessels，具管腔及周壁SHG强胶原信号）见于大多数WHO 2级胶质瘤（星形细胞瘤全部，少突胶质细胞瘤15/17），但仅约半数星形细胞瘤WHO 4级（3/8）及胶质母细胞瘤（28/53）可见，且检出率低；少突胶质细胞瘤WHO 2级vs胶质母细胞瘤差异显著。病理性血管（pathological vessels，管壁SHG信号增强、无/不可辨管腔）仅偶见于WHO 2级（星形细胞瘤1/9，少突胶质细胞瘤5/17），而多见于星形细胞瘤WHO 4级（7/8）及胶质母细胞瘤（45/53），中位数随恶性度升高，星形细胞瘤/少突胶质细胞瘤WHO 2级vs胶质母细胞瘤差异显著。ECM胶原重塑仅见于7例胶质母细胞瘤。

3.5 Intraoperative scoring of CARS-AF-SHG images（CARS-AF-SHG图像的术中评分）

研究人员制定简化术中评分：脂滴存在＝2分；胞质AF细胞缺如＝1分；点状AF缺如＝1分；SHG信号存在＝1分（满分5分）。各样本取5个视野评分，以最高分（score_max）为该例得分。结果显示几乎所有WHO 2级星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤score_max为0～2，满分5仅出现于星形细胞瘤WHO 4级及胶质母细胞瘤；低级别偶见中间分值，高级别因肿瘤内异质性可出现多分值。score_max＝5特异关联WHO 4级肿瘤（星形细胞瘤WHO 4级＋胶质母细胞瘤）。

四、讨论与结论总结

研究人员指出，无标记CARS-AF-SHG多模态成像可全面呈现胶质瘤组织形态化学特征，脂滴（与肿瘤脂质代谢重编程、肿瘤相关泡沫细胞/巨噬细胞相关）、病理性血管/ECM胶原沉积（SHG）及AF模式改变（正常神经元被置换／炎症细胞参与）均与恶性度相关。该方法对冰冻切片与新鲜组织成像特征一致性已有前期证据支持，且评分仅需判断脂滴有无及AF/SHG大致存在与否，不要求区分胞内/胞外LD或进行定量纹理分析，对术中微环境变化具较好鲁棒性。与AI模型相比，此基于形态学标志的直观评分具可解释性、跨中心稳定性及监管友好优势，可与术前MRI、患者年龄、部位等信息整合辅助手术决策。局限性在于评分无法对所有亚型给出唯一诊断，但对WHO 4级具高特异性（score_max=5），且术中多点采样可反映肿瘤内异质性。

结论（Conclusion）翻译：

无标记多光子成像显示出作为术中诊断工具的较强潜力，可使外科医生对易于识别的组织特征进行评分，从而获得关于胶质瘤恶性程度的增强型实时信息。