《Frontiers in Microbiology》：Functional and genomic profiling of lactic acid bacteria reveals specific traits as potential probiotics
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益生菌潜力（probiotic potential）的评估与乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）在发酵食品及人体胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）中的长期安全应用历史密切相关。然而，益生菌特性在不同物种及菌
益生菌潜力（probiotic potential）的评估与乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）在发酵食品及人体胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）中的长期安全应用历史密切相关。然而，益生菌特性在不同物种及菌株间存在显著差异，其基因组决定因素尚不完全清楚。本研究从人口腔及奶酪样本中分离获得27株LAB，采用表型与基因组整合分析方法系统评估其益生菌潜力。基于16S rRNA基因测序的分子鉴定将分离株归入5个LAB物种：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、罗伊氏粘液乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）及副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），其中L. rhamnosus为优势菌株。体外实验显示各分离株在酸耐受性、胆汁耐受性、HT-29肠上皮细胞黏附、抗病原微生物活性及抗生素敏感性等关键益生菌性状上存在显著变异。值得注意的是，L. rhamnosus与L. reuteri表现出最高的酸耐受性及强抗菌活性，而L. reuteri展现出最强的黏附能力。基于上述表型特征，研究人员选取7株代表性菌株进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）及比较基因组学分析。基因组特征分析显示基因组大小约为2.0–3.0 Mb，代谢过程及催化活性相关功能基因类别保守。黏附相关基因的比较分析鉴定出与细胞壁修饰、脂蛋白成熟及自溶素活性相关的扩展基因家族（galE、lgt、ftsW、ypeA、lytG）。次级代谢物预测提示抗菌活性与物种水平的类核糖体合成和翻译后修饰肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide, RiPP）样及聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）簇差异相关，包括mvaS、lagD、LSEI_2163及LSEI_2386等基因。本研究为多样化LAB分离株提供了全面的功能与基因组学评估，并揭示了与益生菌潜力相关的特定遗传特征，支持LAB菌株的理性筛选与下一代益生菌应用开发。
本研究发表于《Frontiers in Microbiology》，旨在通过整合表型与基因组学方法，系统评估分离自人口腔和奶酪样本的乳酸菌益生菌潜力，为下一代益生菌菌株的理性筛选提供理论与遗传依据。
当前益生菌研究领域存在以下问题：尽管LAB的安全应用历史悠久，但益生菌特性在种内和种间差异显著，其基因组决定因素尚不完全清楚；现有研究多集中于有限菌株或单一物种，缺乏跨物种的系统比较，限制了对其功能差异遗传基础的深入理解。因此，开展涵盖多种LAB分离株的整合研究，对于阐明益生菌潜力的基因组基础、支持功能稳健菌株的理性选择至关重要。
本研究从人口腔和奶酪样本中获得27株LAB，通过体外实验评估其酸耐受性、胆汁耐受性、HT-29肠上皮细胞黏附、抗病原微生物活性及抗生素敏感性等关键益生菌性状；进而选取7株代表性菌株进行全基因组测序和比较基因组学分析，聚焦于氨基酸代谢、黏附相关基因及次级代谢生物合成基因簇。研究结论表明，LAB的益生菌相关性状存在显著的菌株特异性差异，氨基酸代谢途径而非一般应激耐受基因与酸耐受性更相关，特定扩展基因家族参与黏附能力的调控，物种水平的次级代谢物生物合成基因簇差异与抗菌活性相关。这些发现支持基于基因组特征的LAB益生菌菌株理性筛选与开发。
本研究采用的主要关键技术方法包括：样本来源为人口腔和当地奶酪样本的27株LAB分离株；通过16S rRNA基因测序进行分子鉴定；利用pH 4.0酸化MRS肉汤和含0.3%（w/v）胆盐的MRS肉汤分别进行酸耐受性和胆汁耐受性测定；采用HT-29人结肠腺癌细胞系进行细菌黏附实验；以无细胞培养上清液（cell-free culture supernatants, CFCS）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌进行抗菌活性 broth 法测定；采用纸片扩散法进行抗生素敏感性检测；选取7株代表性菌株进行PacBio Sequel平台三代长读长测序，经Flye等工具进行从头组装；运用OrthoFinder进行直系同源基因家族分析，CAFE进行基因家族进化分析，MEGA-X构建最大似然法系统发育树；通过BV-BRC的BLASTp工具比对黏附相关蛋白，利用BAGEL4和antiSMASH v8.0预测抗菌生物合成基因簇。
研究结果部分如下：
分子鉴定结果显示，27株分离株经16S rRNA基因PCR鉴定分属5个物种：L. rhamnosus 11株、L. curvatus 4株、L. reuteri 4株、Lc. lactis 4株及L. paracasei 4株；L. rhamnosus为口腔优势菌株，奶酪样本则包含后四种物种。
益生菌在胃肠道条件下的存活评估显示，L. rhamnosus和L. reuteri在pH 4.0条件下存活率分别达98.68±7.63%和98.22±6.34%，而L. curvatus、Lc. lactis（除SGL30066外）及L. paracasei（除SGL30088外）不耐酸；所有耐酸菌株在0.3%胆汁中存活率均超50%。黏附实验表明L. reuteri黏附率最高（80.58±1.82%），其他物种黏附率为49-64%，Lc. lactis SGL30066未黏附。
抗菌活性分析显示，L. rhamnosus对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌活性最强；L. reuteri和L. curvatus对金黄色葡萄球菌抑制效果优于其他病原菌；L. paracasei对白色念珠菌活性较强。
抗生素敏感性检测发现，仅Lc. lactis SGL30067对青霉素呈中介耐药，其余均耐药；L. reuteri、L. curvatus和Lc. lactis对头孢噻吩敏感，多数菌株对氯霉素敏感，所有菌株对庆大霉素耐药。
基因组特征分析表明，7株测序菌株平均基因组长度为2,593,732 bp，L. rhamnosus SGL20010最大（3.01 Mb）；平均GC含量41.59%，CDS数量为1,953–2,815个。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析显示各菌株功能分布相似：分子功能中催化活性和结合相关转录本最多，细胞组分中细胞解剖实体最多，生物学过程中细胞过程和代谢过程最多。基于98,035个氨基酸位点的最大似然法系统发育树清晰将菌株按物种分类聚类。
酸耐受性基因分析显示，酸耐受与非耐受菌株的一般应激耐受基因数量无显著差异；但非酸耐受菌株L. curvatus SGL30018中L-天冬氨酸转化为内消旋-二氨基庚二酸（meso-diaminopimelate, meso-DAP）途径相关基因显著减少，提示氨基酸代谢途径而非经典应激基因更受决定酸耐受性。所有菌株均携带多种氨肽酶基因（pepN、pepC、pepE、pepT、pepV）及氨基酸转运基因（artP、artQ、artM、gltT、yveA）。
黏附相关蛋白基因编码分析通过CAFE分析鉴定出5个扩展基因：SGL30004的lytG（编码外-葡糖胺糖苷酶自溶素）、SGL30018的galE（编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶）和lgt（编码磷脂酰甘油前脂蛋白二酰基甘油转移酶）、SGL30065和SGL30066的ftsW（编码假定肽聚糖糖基转移酶）及ypeA（编码乙酰转移酶）。这些基因分别参与黏附的初始阶段（细胞壁和表面结构准备）、中间阶段（表面蛋白和脂蛋白黏附因子展示）和最终阶段（促进细胞表面黏附）。BV-BRC BLASTp比对已知黏附蛋白显示，L. reuteri SGL30004具有更多可识别的黏附相关蛋白。
具有抗菌活性的次级代谢物预测显示，L. curvatus SGL30018未检测到生物合成基因簇，其余6株均含有簇；L. rhamnosus SGL20010含1个III型聚酮合酶（T3PKS）簇和1个RiPP样簇，与其最强体外抗菌活性一致。各T3PKS簇核心基因为mvaS，RiPP样簇核心基因为lagD。BAGEL4预测L. rhamnosus SGL20010含enterocin_X、carnocin_CP52和LSEI_2386核心基因的簇，L. reuteri SGL30004含enterolysin_A核心基因的簇，L. paracasei SGL30088和SGL30089各含3个簇（核心基因分别为LSEI_2163；enterocin_X与LSEI_2386；enterolysin_A）。
讨论部分总结如下：本研究揭示了LAB关键益生菌相关性状的显著菌株特异性变异，强调在菌株水平而非仅物种水平评估的重要性。体外简化模型筛选结果需在更接近生理条件的动态系统中验证；无细胞培养上清液的抗菌活性可能源于有机酸、过氧化氢和细菌素样肽等多种因素，需进一步鉴定特定抗菌化合物；抗生素耐药性需谨慎解读，固有耐药与获得性耐药的区分及水平转移潜力评估需进一步基因组分析。
酸耐受性分析表明，一般应激响应基因的分布不足以解释表型差异，氨基酸代谢途径（尤其是L-天冬氨酸至meso-DAP的转化）与酸耐受模式相关性更强。L. curvatus SGL30018该途径基因显著减少支持此观点。黏附相关基因比较鉴定出参与不同黏附阶段的扩展基因家族，其中仅L. reuteri SGL30004携带的lytG基因可能通过改变表面电荷、疏水性及eDNA释放解释其最强黏附表型。抗菌途径基因组分析揭示物种水平差异，L. rhamnosus SGL200010独特同时携带T3PKS和RiPP样簇与其强抗菌活性一致，核心基因包括mvaS、lagD、enterolysin_A及LSEI家族基因。
尽管存在物种水平基因组差异，同种内菌株差异更为细微，全基因组比较常不足以解释表型差异，基因表达调控变异可能起关键作用，需转录组学等进一步实验验证。研究基于相关性分析鉴定的基因组特征与表型关联，需通过基因敲除或表达研究等功能验证确立因果关系。
研究结论：本研究通过整合表型与基因组分析，为LAB益生菌相关候选基因提供了新见解，强调了菌株水平评估的必要性，并为未来靶向基因的功能研究奠定了基础。
