《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Functional Characterization and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Donkey Milk
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本研究旨在对从驴乳（donkey milk）中分离得到的乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）进行特征分析，并评估筛选菌株的益生菌（Probiotic）特性。在为期一年的采样中收集共计97株分离株，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Ma
本研究旨在对从驴乳（donkey milk）中分离得到的乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）进行特征分析，并评估筛选菌株的益生菌（Probiotic）特性。在为期一年的采样中收集共计97株分离株，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）鉴定为8种LAB物种，以干酪乳酸杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）和植物乳酸杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）为主。基于初步安全性及功能性初筛，选取22株L. paracasei和11株L. plantarum进行进一步表征。所有分离株均为γ-溶血性（γ-hemolytic）且脱氧核糖核酸酶（DNase）阴性。所选菌株表现出对酸性条件（pH 2–3）及胆盐（最高1%）的耐受性。细胞表面疏水性（Cell surface hydrophobicity）普遍较高，自聚集（Auto-aggregation）率为3.2%–52.1%，共聚集（Co-aggregation）率为-39%–47.9%（依菌株而异）。胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）产量为348.4–622.9 μg/mL葡萄糖当量，傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）分析显示EPS样品间存在结构差异。6/22株L. paracasei和7/11株L. plantarum对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、O157:H7致泻性大肠杆菌（Escherichia coli O157:H7）及沙门氏菌属（Salmonella spp.）具有抗菌活性。中和实验表明该抗菌作用主要归因于有机酸产生及低pH环境。所有分离株对氨苄西林（ampicillin）表现为强抑制反应，部分菌株对万古霉素（vancomycin）表现为弱抑制反应。综上所述，驴乳被鉴定为具有益生菌相关功能特征LAB的潜在来源，但其安全性及功能效力尚需进一步的分子、最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）及体内实验确认。
论文解读：驴乳来源乳酸菌的益生菌特性功能表征研究
该研究发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》。目前关于驴乳微生物组的研究多集中于培养法鉴定菌群组成，而针对驴乳中分离出的乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）尤其是干酪乳酸杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）和植物乳酸杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）在菌株水平的益生菌相关特性——如胃肠液耐受、黏附相关特性、胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）产量及抗菌活性的系统性功能表征仍较匮乏。驴乳因富含溶菌酶（lysozyme）、乳铁蛋白（lactoferrin）等生物活性蛋白而构成选择性抑菌环境，可能筛选出具有较强抗逆性的LAB，是发掘新型益生菌（Probiotic）株的理想来源。为此，研究人员开展本研究以分离鉴定驴乳中LAB，并系统评估候选L. paracasei和L. plantarum菌株的安全性、胃肠模拟耐受性、黏附潜力、EPS合成能力及抗菌谱，以期为功能性食品开发提供菌株依据。
主要关键技术方法
研究人员从土耳其Bal?kesir省商业驴场采集50份散装驴乳样本（每周采集持续约一年），进行LAB分离纯化及革兰氏染色与触酶试验初筛。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行种水平鉴定（得分≥2.0）。选取无毒力因子（γ-溶血试验及脱氧核糖核酸酶DNase试验阴性）的L. paracasei（22株）和L. plantarum（11株）进行功能评价：模拟胃肠液耐受性测定（pH 2.0/3.0及0.3%–1%牛胆盐oxgall孵育后活菌计数）；苯酚-硫酸法测定EPS产量并结合衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）初步表征；微生物黏附至溶剂法（Microbial Adhesion to Solvents, MATS）测细胞表面疏水性；分光光度法测自聚集（Auto-aggregation）率及与E. coli O157:H7共聚集（Co-aggregation）率；Kirby–Bauer纸片扩散法测抗生素敏感性表型；琼脂孔扩散法检测无细胞上清（Cell-Free Supernatant, CFS）对食源性病原菌的抑菌圈，并设置pH中和对照组区分有机酸依赖型抑菌。所有实验设三重复，采用单因素方差分析及Tukey事后检验（p<0.05为显著）。
研究结果
分离与鉴定（Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria）
从185株细菌中鉴定出97株LAB，分属8个物种。驴乳中推定LAB平均计数为3.8±0.7 log10CFU/mL（MRS琼脂），肠球菌（Enterococcus spp.，主要为E. faecium 24.7%、E. faecalis 17.5%）占比最高，其次为L. paracasei（22.7%）和L. plantarum（11.3%）。因肠球菌潜在毒力及耐药转移风险，后续功能研究聚焦于L. paracasei与L. plantarum共33株。
胆汁盐与酸耐受性（Bile Salt and Acid Tolerance）
多数L. plantarum比L. paracasei对胆盐耐受性更强，部分L. paracasei（如BAUN4、BAUN20）在0.3%–1%胆盐中存活率显著下降。酸性耐受方面，仅少数株（L. paracasei BAUN7、BAUN8及L. plantarum BAUN10）可在pH 2存活，大部分菌株在pH 3下保持活力，表明存在菌株间胃肠环境适应性差异。
溶血活性、DNase试验及产酸能力（Hemolytic Activity, DNase Test and Acid Producing Capacity）
全部33株均呈γ-溶血（无溶血）且DNase阴性，符合益生菌基本安全要求。培养24 h后培养液pH降至4.16–5.17，表明各菌株具有不同程度的有机酸产酸能力。
EPS产量及FTIR表征（EPS Production and FTIR Characterization of EPS）
EPS产量为348.4–622.9 μg/mL葡萄糖当量，L. paracasei总体高于L. plantarum（p<0.05），高产株包括L. paracasei BAUN8、BAUN9、BAUN11。FTIR光谱显示典型多糖特征吸收峰：3200–3500 cm-1（O–H伸缩振动）及~1700–1750 cm-1（C=O伸缩振动），菌株间峰强度与分布存在差异，提示EPS结构具株间异质性。
聚集特性与细胞表面疏水性（Aggregation Properties and Cell Surface Hydrophobicity）
自聚集率最高为L. paracasei BAUN9（52.1%），L. plantarum整体中等。与E. coli O157:H7共聚集率最高达47.9%（L. paracasei BAUN15）。绝大多数菌株细胞表面疏水性>95%。上述指标表明部分菌株具备潜在的肠道黏附与定植前期特征。
抗生素敏感性谱（Antibiotic Susceptibility Profiles）
所有菌株对氨苄西林呈强敏感（大抑菌圈），对青霉素、四环素、卡那霉素、链霉素呈中度敏感；部分L. plantarum（63.6%）和L. paracasei（36.4%）对万古霉素敏感性降低，属乳酸杆菌固有耐药性（天然D-Ala–D-Lac肽聚糖前体）。未开展耐药基因分子检测。
选定LAB菌株的抗菌活性（Antimicrobial Activity of Selected LAB Strains）
13株LAB（6株L. paracasei及7株L. plantarum）的未中和CFS对S. aureus、L. monocytogenes、E. coli O157:H7及Salmonella spp.产生抑菌圈（14–25 mm）；将CFS调至pH 6.0后抑菌作用完全消失，证实抑菌源于有机酸及低pH，无非蛋白类细菌素检出。
讨论与结论总结（Discussion & Conclusion Translation）
讨论指出驴乳LAB群落以肠球菌和LAB为主，与既往报道一致；筛选出之L. paracasei及L. plantarum具胃肠模拟耐受、安全表型（γ-溶血/DNase阴性）、较强疏水性与聚集能力及EPS产出，其抑菌归因于有机酸产生。局限性含未做16S rRNA测序复核、未进行黏附于Caco-2细胞模型或体内实验、未做EPS精细组分分析及MIC/耐药基因检测。株间功能差异强调益生菌潜力属株特异性而非种水平共性。结论如下：
综上，本研究表明驴乳含有多样化LAB种群，其中L. paracasei与L. plantarum是具显著益生菌潜能的优势菌种。若干分离株展现出良好的胃肠条件耐受、抗菌活性、黏附相关特征及EPS产生，可作为生物技术及益生菌应用的候选株。但株间存在明显变异，益生菌潜质是株而非种的普遍属性。鉴于本研究基于体外表型筛选且未包含基因组确证、EPS成分详析及体内验证，需进一步开展分子与动物实验以确认最优分离株的安全性、功能效力及益生菌潜能。
