姜黄素介导的抗微生物光动力疗法以物种依赖性方式预防念珠菌生物膜形成

《Lasers in Medical Science》：Curcumin-mediated antimicrobial photodynamic therapy prevents Candida biofilm formation in a species-dependent manner

　　

本研究旨在系统评估由450 nm LED光激活的姜黄素介导的抗微生物光动力疗法（antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）对临床相关念珠菌（Candida）物种生物膜形成和成熟生物膜的抗生物膜效能，特别强调预防潜力和物种依赖性易感性。研究人员在五种标准念珠菌菌株中研究了生物膜形成和成熟。采用姜黄素处理生物膜形成（预防方法）和已建立的生物膜，随后用450 nm LED光照射。使用结晶紫试验定量评估生物膜生物量。进行比较分析以确定对aPDT的物种依赖性反应。使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，并使用Kruskal-Wallis检验进行组间比较，必要时进行Dunn事后检验。所有念珠菌菌株均表现出显著的生物膜形成能力，被分类为强生物膜产生者，但杜氏念珠菌（Candida dubliniensis）除外，其表现出中等生物膜形成。姜黄素介导的aPDT在所有测试物种中显著抑制了生物膜发育（p??0.05）。姜黄素介导的aPDT对念珠菌生物膜形成发挥了显著的预防性抗生物膜效应，但对成熟生物膜表现出有限且不显著的活性。这些发现将姜黄素介导的aPDT定位为预防念珠菌生物膜建立的有希望的策略，同时表明需要改进光敏剂递送和优化照射方案以增强对已建立生物膜的活性。

念珠菌（Candida）生物膜感染是临床医疗面临的重大挑战。生物膜是由微生物聚集形成的三维群落，被胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质包裹，该基质主要由多糖、蛋白质和核酸组成，构成保护性屏障，赋予生物膜对抗微生物药物和宿主免疫反应的强大耐药性。由于抗真菌药物类别有限，且现有药物对生物膜相关感染的疗效逐渐下降，开发替代治疗策略迫在眉睫。既往研究表明，预防念珠菌生物膜的初始形成比治疗已成熟的耐药性生物膜更为有效。抗微生物光动力疗法（antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）作为一种新兴的物理治疗方法，通过光敏剂（photosensitizer, PS）在特定波长光照下与分子氧反应产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），进而对微生物细胞造成不可逆的氧化损伤，具有广谱抗菌活性和低耐药性诱导潜力。天然光敏剂姜黄素（curcumin）因其良好的生物相容性和ROS生成能力受到关注，但针对多种临床相关念珠菌物种的系统性抗生物膜评价，尤其是在预防与治疗两个阶段的效果比较和物种依赖性方面，尚缺乏深入数据。因此，研究人员开展了本研究，旨在系统评估由450 nm LED光激活的姜黄素介导的aPDT对五种标准念珠菌菌株生物膜形成（预防策略）和成熟生物膜的抑制效能，明确物种依赖性差异，并探讨其潜在机制。该研究论文发表在《Lasers in Medical Science》。

本研究涉及的主要关键技术方法包括：采用五种标准念珠菌菌株（均来源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC），包括C. albicans ATCC 10231、C. metapsilosis ATCC 96143、C. dubliniensis ATCC MYA-646、C. orthopsilosis ATCC 96141和C. parapsilosis ATCC 22019）。生物膜生物量通过结晶紫染色法测定，以620 nm处的光密度（OD_620nm）表示。光动力疗法中，姜黄素溶液（终浓度320 μM）与菌液共孵育20分钟（预照射期）后，使用450 nm LED光源（功率密度0.02165 W/cm2）照射1小时17分钟（总剂量100 J/cm2）。实验分两组：预防组在生物膜形成前进行姜黄素光照处理；成熟组对已培养48小时的成熟生物膜进行相同处理。数据经Shapiro-Wilk检验评估正态性，采用Kruskal-Wallis检验进行组间比较，必要时辅以Dunn事后检验，显著性水平设为p<0.05。

研究结果部分如下：

**结晶紫法测定总生物量**：通过定量评估五种菌株的OD_620nm值，发现所有菌株均能形成生物膜。C. metapsilosis ATCC 96143的OD_620nm值最高（0.478±0.191），为强生物膜产生者；C. dubliniensis ATCC MYA-646的OD_620nm值最低（0.292±0.129），仅被分类为中等生物膜产生者；其余菌株（C. albicans ATCC 10231、C. orthopsilosis ATCC 96141、C. parapsilosis ATCC 22019）均属强生物膜产生者。这一分类确认了后续aPDT评价的实验基础。

**光动力疗法对生物膜形成的影响**：姜黄素介导的aPDT显著抑制了所有测试菌株的生物膜形成（p<0.05）。与各自非光活化对照组相比，抑制率分别为：C. metapsilosis 86.82%、C. orthopsilosis 85.05%、C. parapsilosis 83.33%、C. dubliniensis 75.34%、C. albicans 68.19%。处理组的OD_620nm值接近未接种对照组，提示早期黏附和生物量积累受到严重破坏。该预防性抗生物膜效应主要归因于光照激活姜黄素后产生的ROS，对细胞膜、蛋白质和核酸造成氧化损伤，并干扰早期EPS基质形成。

**光动力疗法对成熟生物膜的影响**：对于已形成的48小时成熟生物膜，姜黄素介导的aPDT表现出高度物种依赖性且有限的抑制效果。C. parapsilosis的抑制率最高（49.63%），C. dubliniensis最低（仅0.64%）。尽管部分物种观察到一定的生物量减少，但所有处理组与对照组之间的差异均无统计学显著性（p>0.05）。该现象表明成熟生物膜的致密三维结构和EPS屏障限制了光敏剂的渗透和ROS的扩散，同时代谢异质性细胞和持久细胞的存在进一步降低了敏感性。相比之下，仅光照而不加姜黄素的对照组成熟生物膜生物量未受明显影响，证明aPDT效应依赖光活化。

在讨论部分，研究人员指出，姜黄素介导的aPDT在预防生物膜形成方面具有显著潜力，这一效果与生物膜早期发育阶段的脆弱性密切相关——此时细胞暴露度高、EPS基质尚未形成，有利于光敏剂进入和ROS杀伤。然而，对成熟生物膜的效果有限，需要改善光敏剂递送、调整光剂量或联合其他策略来克服生物膜抵抗。研究结论部分原文翻译如下：本研究检验了姜黄素在450 nm LED光激活下对五种念珠菌物种生物膜的效果。研究人员从预防和治疗两个角度分别探究了其抑制生物膜形成和清除已成熟生物膜的能力。结果显示，光活化姜黄素对ATCC标准菌株的生物膜形成均表现出显著抑制，其中C. metapsilosis和C. parapsilosis的抑制率最高（分别为86.72%和83.26%）。该抑制作用与光活化过程中产生的活性氧（ROS）导致的细胞关键组分不可逆氧化损伤有关，从而阻碍了初始黏附和聚合物基质形成。尽管aPDT对48小时成熟生物膜表现出物种依赖性活性，但其效能显著降低；C. parapsilosis生物量减少最多（49.63%），而C. dubliniensis最低（仅0.64%）。这种差异提示成熟生物膜的结构构成物理屏障，阻碍光敏剂渗透和ROS扩散，同时其中存在的代谢异质性细胞和持久细胞群体可能增加了耐药性。姜黄素介导的aPDT对生物膜形成有强抑制作用，具有显著的预防潜力，但对成熟生物膜的疗效有限且呈物种依赖性，反映了既定生物膜结构的内在耐药性。这些发现表明，aPDT更适合作为预防策略而非成熟生物膜的根除手段，无需直接评估中间发育阶段。因此，优化光动力参数并开发协同策略以增强光敏剂渗透并克服生物膜相关耐药性，对于提高其治疗适用性至关重要。