《Advanced Functional Materials》：A Molecular Shielding Strategy to Develop Low Protein Binding, Renal Clearable Pan-Cancer Near-Infrared Probes
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近红外（NIR）荧光七甲川菁（HMC）染料具有内在肿瘤靶向能力，是检测实体肿瘤的有前景的探针。然而，HMC染料通常是两亲性分子，导致全身给药后与血液蛋白（主要是白蛋白）非特异性结合。虽然白蛋白结合可以延长血液循环时间并增强肿瘤积累，但它也可能导致显著的健康组织
近红外（NIR）荧光七甲川菁（HMC）染料具有内在肿瘤靶向能力，是检测实体肿瘤的有前景的探针。然而，HMC染料通常是两亲性分子，导致全身给药后与血液蛋白（主要是白蛋白）非特异性结合。虽然白蛋白结合可以延长血液循环时间并增强肿瘤积累，但它也可能导致显著的健康组织摄取，导致低肿瘤-背景信号比（TBR）和潜在毒性。在此，研究人员报告了一种分子屏蔽策略，以防止肿瘤靶向HMC染料的非特异性蛋白结合。研究人员开发了一个合理设计的分子屏蔽NIR荧光探针库，基于临床批准的HMC染料吲哚菁绿（ICG）。为了屏蔽ICG的非特异性蛋白相互作用，其侧链被修饰为不同数量的带电氨基酸残基，从而将ICG转化为低蛋白结合、肾可清除的泛癌靶向探针。这些屏蔽的ICG分子在几天内显示出强烈的肿瘤积累和最佳的组织清除，实现了高对比度肿瘤成像，TBR值达到8，并在原位啮齿动物肿瘤模型中显示清晰的肿瘤边界。这些新型肿瘤靶向NIR探针代表了一个临床可转化的平台，用于癌症检测和治疗，其模块化分子结构由无毒的FDA批准组件组成。
**论文解读文章**
**研究背景、问题与意义**
近红外（NIR）荧光染料凭借低组织背景、高穿透深度和低光毒性，在实体肿瘤检测中具有巨大潜力，尤其有助于术中实时勾勒肿瘤边界，提升手术切除的彻底性。然而，目前临床常用染料如吲哚菁绿（ICG）缺乏肿瘤特异性，且因两亲性分子结构在血液循环中易与血浆蛋白（主要为白蛋白）非特异性结合，导致健康组织非特异性摄取和缓慢的肝脏清除（数周级别），造成低肿瘤-背景信号比（TBR）和潜在毒性。尽管基于生物标志物靶向或酶激活的探针（如pafolacianine和pegulicianine）已获FDA批准，但受限于生物标志物在健康组织的表达及肿瘤内空间异质性，仍存在敏感性和特异性不足。另一类具有内在肿瘤靶向能力的七甲川菁（HMC）染料（如MHI-148）可通过有机阴离子转运多肽（OATP）富集于多种实体肿瘤，但同样面临蛋白结合和缓慢清除的问题。因此，亟需开发能兼顾强肿瘤积累与快速健康组织清除的新策略。本研究提出一种分子屏蔽策略，以临床ICG为平台，通过修饰带电氨基酸，平衡了肿瘤靶向与清除动力学，实现了高对比度泛癌NIR成像。该工作发表于《Advanced Functional Materials》。
**主要关键技术方法**
研究人员以ICG为母体，通过硫醇-马来酰米德反应在其侧链中段半胱氨酸上连接不同数量（2-6个）的天冬氨酸（D）或赖氨酸（K）残基，制备了系列分子屏蔽探针（MS-ICGs，如2D-ICG、6D-ICG等）。采用n-辛醇/磷酸盐缓冲液（PBS）分配实验测定pH依赖性分配系数（LogD）评估水溶性；纳米颗粒追踪分析（NTA）检测聚集行为；天然凝胶电泳分析血浆蛋白结合；在BALB/c、C57BL/6、NSG及FVB/N小鼠中开展药代动力学、组织分布及肿瘤成像实验；使用OATP1a/1b基因簇敲除小鼠验证OATP介导的清除机制；利用4T1、HCT-116、HeLa、A375、LLC1、MC38、TRAMP-C2及RG2等多种人/鼠细胞系构建皮下/原位肿瘤模型（细胞来源：ATCC、Creative Biogene等；小鼠品系：The Jackson Laboratory、Taconic Biosciences；大鼠：Charles River）。此外，采用荧光成像（IVIS）、共聚焦显微镜及切片扫描仪分析探针分布。
**研究结果**
**2.1 分子屏蔽ICG（MS-ICGs）的设计与合成**
研究人员在ICG侧链连接2-6个带电天冬氨酸（D）或赖氨酸（K），通过高效液相色谱（HPLC）纯化，LC-MS和核磁共振（NMR）确认结构。所有MS-ICG均储存于-20°C。
**2.2 MS-ICGs的溶解度和光学性质**
n-辛醇/PBS分配实验显示，游离ICG的LogD为1.11（倾向有机相），而所有MS-ICG的LogD均为负值（倾向水相），且天冬氨酸数量越多，LogD越低（6D-ICG最亲水）。在PBS中，游离ICG因聚集导致吸收光谱宽化、荧光淬灭；MS-ICG（尤其6D-ICG）在50 μm浓度下仍保持清晰吸收峰（782 nm和717 nm），荧光显著增强。纳米颗粒追踪分析（NTA）确认6D-ICG在10 μm浓度下无聚集。6D-ICG可直接溶于PBS至~6 mg/mL，溶解度较ICG提升约6.7倍。
**2.3 MS-ICGs通过OATP介导细胞内化**
在4T1和A375细胞中，游离ICG的摄取高于天冬氨酸修饰的MS-ICG，且随天冬氨酸数增加摄取降低。6K-ICG因正电荷导致高摄取但大于5 μm时有细胞毒性。广谱OATP抑制剂溴磺酞（BSP）显著降低游离ICG和6D-ICG的摄取（约50-100个细胞计数，p<0.0001），而6K-ICG不受影响，表明其通过非特异性膜结合摄取。以非HMC染料Cy5制备的类似物6D-Cy5作为阴性对照，其摄取不受BSP影响，进一步证实MS-ICG的OATP依赖性。
**2.4 MS-ICGs减少非特异性蛋白结合并改善药代动力学**
在人血浆（10%）中，游离ICG的荧光增强约10倍（表明蛋白结合），而天冬氨酸MS-ICG的荧光增强随天冬氨酸数增加而减弱，6D-ICG仅增强约1.25倍，且4小时内保持稳定。天然凝胶电泳显示，游离ICG和2D-ICG与白蛋白强结合；4D-ICG约40%游离；6D-ICG约80%呈游离态。小鼠血浆中结果一致。体内药代动力学：游离ICG在<5分钟从血液中清除；6D-ICG的循环半衰期延长至~2小时，注射后6小时仍有约12%注射剂量（ID）在血中。6K-ICG因正电荷和聚集倾向在2小时内几乎完全清除。清除研究中，游离ICG和2D-ICG仅通过粪便（肝脏）清除；而4D-ICG和6D-ICG在尿液中检测到显著荧光（6D-ICG在30分钟至6小时浓度>5 nm），表明肾清除路径。在OATP敲除小鼠中，6D-ICG清除更慢（血液、尿液和粪便中浓度更高），且2天后各组织荧光信号高于野生型，证实OATP介导清除。
**2.5 MS-ICGs的肿瘤特异性积累**
在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中，天冬氨酸MS-ICG（尤其6D-ICG）在肿瘤部位呈现强荧光，而游离ICG无肿瘤特异性信号。6D-ICG的TBR随时间升高，24-48小时达~8。离体组织成像显示，6D-ICG的肿瘤-肝脏比约8.5，肿瘤-肾脏比约2。使用5倍高剂量游离ICG（~9.7 mg/kg）时，肿瘤信号仍比6D-ICG低约10倍。共聚焦显微镜显示6D-ICG在肿瘤微环境（TME）内均匀分布，并被mCherry标记的4T1癌细胞有效内化。研究人员提出积累机制：分子屏蔽使6D-ICG保持游离态，延长循环时间，通过OATP介导摄取富集于肿瘤。
**2.6 6D-ICG在多种实体肿瘤模型中特异性积累**
在6种不同实体瘤模型（HCT-116、HeLa、A375、LLC1、MC38、TRAMP-C2）中，6D-ICG均显示强肿瘤积累，且所有模型的肿瘤信号显著高于肝脏信号（p<0.05至p<0.0001）。在脂多糖（LPS）诱导的乳腺炎症模型中，6D-ICG在炎症组织的荧光仅微弱增加，而在4T1肿瘤中的荧光比炎症组织高约8倍，表明其能在炎症背景中区分肿瘤。
**2.7 6D-ICG实现大鼠原位胶质母细胞瘤的敏感检测**
在mCherry标记RG2细胞的大鼠颅内胶质母细胞瘤模型中，注射6D-ICG后2天，IVIS成像显示6D-ICG荧光与mCherry肿瘤信号高度重叠，肿瘤-健康脑比约7.9。全脑切片扫描显示6D-ICG在肿瘤内均匀分布，清晰勾勒肿瘤边界，健康脑组织无荧光。共聚焦高分辨率图像进一步确认肿瘤边界清晰及癌细胞的内化。研究提示6D-ICG不能透过完整的血脑屏障（BBB），但胶质母细胞瘤破坏BBB，使其进入TME后通过过表达的OATP内化。
**讨论总结与结论翻译**
本研究开发的分子屏蔽策略有效防止了ICG的血浆蛋白结合和聚集，显著延长其血液循环半衰期（从<5分钟至~2小时）并引入肾清除路径。最佳探针6D-ICG在8种小鼠和大鼠肿瘤模型中实现了TBR高达8的特异性积累，且在肿瘤微环境中均匀分布并完全内化于癌细胞。该分子由FDA批准的ICG和短肽组成，具有非毒性、模块化的特点，为荧光引导手术提供了极具临床转化潜力的平台。结论原文翻译：“总之，研究人员开发了分子屏蔽、低蛋白结合、肾可清除的NIR荧光探针，通过OATP介导的摄取特异性积累于多种实体肿瘤。研究表明，该屏蔽策略显著阻止了临床HMC染料ICG在血浆中的聚集和非特异性蛋白结合，从而将血液半衰期从<5分钟延长至约2小时，并实现最亲水化合物（6D-ICG）的肾清除。6D-ICG在八种小鼠和大鼠肿瘤模型中实现肿瘤特异性积累，TBR高达8。在相同浓度下，游离ICG注射未检测到任何肿瘤积累。体外实验表明，6D-ICG通过OATP被癌细胞摄取。荧光成像显示，在同基因小鼠乳腺癌和大鼠胶质母细胞瘤模型中，肿瘤微环境内积累均匀，肿瘤边界清晰，几乎完全内化于癌细胞。最佳化合物6D-ICG凭借其显著的肿瘤积累能力以及由短肽和FDA批准染料组成的无毒结构，在实体肿瘤荧光引导手术中具有重要的临床转化潜力。此外，6D-ICG的模块化设计可使其与多种造影剂或治疗分子偶联，实现癌症特异性递送。”
