双互穿网络复合生物墨水用于多组分三维生物打印和生物制造

《Advanced Functional Materials》：Double-Interpenetrating Composite Bioink for Multi-Component 3D Bioprinting and Biofabrication

　　

能够在环境条件下生成复杂结构的生物墨水是三维生物打印（3DBP）转化的关键方面。生物墨水通常针对特定应用进行定制以满足独特要求，但这可能削弱其更广泛的实用性。尽管生物打印已取得显著进展并能制造相当复杂的物体，但再现天然组织的空间和力学属性仍需多材料组装步骤。研究人员在此提出一种基于羧化琼脂糖（CA）和海藻酸钠（Alg）双互穿网络（dIPN）的生物墨水系统，该系统兼具物理交联和离子交联。CAAlg系统结合了两种水凝胶系统的关键属性，表现出优异的剪切稀化行为和剪切变形恢复能力，从而能够在环境条件下以低气压进行可靠打印。dIPN赋予打印结构即时的物理稳定性，通过利用界面离子键合将打印物体后续组装成复杂三维结构，无需支撑浴。低气压确保了打印过程中及打印后细胞的高存活率，总之，这为探索CAAlg在室温下将不同和定制的软材料多组件组装成单一构造的生物制造铺平了道路。

**研究背景与问题**
在生物材料领域，尽管材料本身取得了显著进展，但将其加工成具有生物活性的三维结构一直是限制再生疗法潜力的关键瓶颈。三维生物打印（3DBP）作为增材制造的一个分支，为制备载细胞构造（construct）用于体外疾病模型和体内应用带来了新可能，而生物墨水（bioink）则是实现这一目标的核心要素。当前生物墨水通常为特定应用定制，可能牺牲通用性；且虽然打印技术可构建复杂物体，但重现天然组织的空间与力学异质性仍需多材料组装策略。现有水凝胶系统（如丙烯酸酯类依赖紫外光交联易损伤细胞，离子交联系统如海藻酸钠力学稳定性不足需要后交联，物理交联系统如琼脂糖脆性大）各有局限。为此，研究人员基于羧化琼脂糖（CA）和海藻酸钠（Alg）的双互穿网络（dIPN）系统，开发了一种兼具物理（热致凝胶）与离子（钙介导）交联的复合生物墨水CAAlg，旨在实现室温下低气压打印、免支撑浴的多组件组装，并保持高细胞活性。该工作发表在《Advanced Functional Materials》。

**关键技术方法**
研究人员通过流变学表征（剪切速率扫描、振荡频率扫描、循环剪切、蠕变-恢复及应力松弛测试）评估打印适性；利用单轴压缩测试量化CaCl₂交联时间对力学性能的影响；采用临界点干燥（CPD）结合扫描电子显微镜（SEM）观察内部纳米结构；设计3D打印模型并通过手工后组装与钙离子键合实现多组件构建。细胞相容性采用HeLa细胞系，通过MTT法测定代谢活性，并用Calcein AM/EthD-1活死染色评估细胞存活率。

**研究结果**

**2.1 CAAlg具备生物打印所需的流变学属性**
通过流变学检测三种不同羧化度配方（CALAlg、CAMAlg、CAHAlg），发现所有配方均表现出显著剪切稀化特性，流变指数n在0.578–0.646之间，屈服应力低（20–40 Pa），有利于低气压打印；振荡频率扫描显示储能模量G′始终大于损耗模量G′′，损耗角正切tan(δ)在0.1–0.2之间，表明良好的形状保持能力。与明胶-海藻酸钠对比，CAAlg黏度更低且弹性更显著。

**2.2 CAAlg生物墨水展现快速弹性恢复及抗蠕变性能**
循环剪切测试（高/低剪切交替）表明，所有配方恢复指数超过96%，恢复时间仅3–6秒，远优于明胶-海藻酸钠（约80%恢复且无法达到90%）。蠕变-恢复实验显示在25%–75%屈服应力下，柔量（compliance）在0.12–0.27 Pa^-1，恢复率>70%；应力松弛约50%，表明能有效耗散应力并抵抗缓慢变形。打印验证了分叉管、圆柱、半球及网格等复杂几何结构。

**2.3 CaCl₂暴露时间决定压缩力学性能**
无限制压缩测试显示随着20 mm CaCl₂浸泡时间增加，压缩模量、峰值应力和断裂能显著上升；60分钟后模量达到初始值2–3倍，峰值应力提高一个量级以上，100–120分钟趋于平台。小体积样品（接近打印尺寸）在30分钟内即达平台，表明交联受扩散控制。在DMEM中浸泡后力学略有下降但仍优于未交联对照。

**2.4 CAAlg打印结构呈现纳米域且无相分离**
SEM观察显示钙交联后所有配方内部形成约20 nm的结节状纳米结构（nodular domains），而未交联的CAAlg呈纤维网状；表面较内部更致密，但内部同样存在纳米域，表明钙扩散充分。三种配方间无明显形态差异。

**2.5 打印后离子键合实现多组件组装，无需支撑相**
利用CaCl₂浸泡5分钟实现键合，展示了多种组装：双喷嘴共打印（同心圆/方框）；三明治结构（可准确堆叠）；空心三角双金字塔（两半拼接）；互锁环（切断重连）；含4% PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）的三网络柱状堆叠。所有构造在超纯水中稳定>2个月，在DMEM/37°C下稳定>7天，破坏发生在本体而非界面。

**2.6 CAAlg系统在打印与钙交联过程中表现细胞相容性**
HeLa细胞载入CAAlg并通过24G喷嘴挤出（模拟打印），随后在20 mm CaCl₂中浸泡0–30分钟。MTT法显示7天内代谢活性无明显下降；活死染色显示24小时存活率>80%，即使30分钟浸泡组也与此一致。少量下降归因于基质缺乏细胞黏附位点而非钙毒性。

**总结与讨论**
该研究系统评估了羧化琼脂糖-海藻酸钠（CAAlg）双网络水凝胶系统用于生物制造的性能。研究人员将先前用于高性能薄膜的配方转化为3D生物打印，全面表征了其流变学、力学、微观结构和细胞相容性。系统利用CA的热可逆凝胶化和Alg的钙介导交联形成双互穿网络，实现室温打印与打印后组装，无需光引发剂或紫外光。通过改变羧化度和后交联时间可调谐力学性能。钙诱导的纳米域赋予应力耗散和黏弹性恢复能力。离子交联步骤可用于将打印部件不可逆键合成多组件组装，其复杂程度可比肩使用支撑浴的方法。细胞相容性实验证明挤出过程中及挤出后细胞存活率优异。简言之，CAAlg系统代表了一个简单可调的生物墨水平台，适用于室温下多材料生物制造。由于钙键合步骤与热凝胶网络解耦，不同CAAlg变体甚至其他相容水凝胶可组合成单个构建体，实现刚度和成分的空间控制，而不改变打印流程。结合常规生物功能化策略，该平台在多材料组织模型制造和软体生物医学装置快速原型中具有应用前景。这种物理凝胶生物墨水辅以二次离子键合的策略为生物制造提供了新途径，并可推广至软体机器人、柔性电子等领域。