基于适应性实验室进化（ALE）与组学技术的大肠杆菌代谢工程：限氧条件下高效生产L-缬氨酸（L-valine）

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Metabolic engineering of Escherichia coli based on adaptive evolution and omics technology for highly efficient l-valine production under oxygen-limited conditions

　　

在工业生产中，源自碳源的靶标产物得率常因微生物细胞工厂内细胞代谢的竞争效应而降低。L-缬氨酸（L-valine）的发酵生产即典型受制于该困境，严重阻碍其经济规模化工业生产。本研究旨在构建能在限氧条件下通过减少三羧酸循环（TCA cycle）对前体丙酮酸（pyruvate）的消耗，从而高效合成L-缬氨酸且得率高的细胞工厂。研究人员以限氧条件下的适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）为基础进行代谢工程改造，获得进化菌株ALE2-40，其细胞生长改善且L-缬氨酸得率提升。通过比较组学分析与验证实验发现，ALE过程中丙酮酸脱氢酶（Pyruvate Dehydrogenase, PDH）活性和NADH可用性均显著提高；此外有益靶标可潜在贡献于NAD+/NADH和ATP池，进而进一步促进L-缬氨酸合成。基于上述结果对进化菌株ALE2-40进行反向工程（reverse engineering）。最终获得的最终工程菌株VAL19在5 L生物反应器限氧条件下28 h内L-缬氨酸（L-valine）产量达93.7 g/L，葡萄糖得率高达60.4%（相当于理论得率的92.9%），产率为3.35 g/L/h。结果确立了L-缬氨酸发酵生产的新标杆，为迄今报道最高得率与产率。

论文解读：《Metabolic engineering of Escherichia coli based on adaptive evolution and omics technology for highly efficient L-valine production under oxygen-limited conditions》发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》

L-缬氨酸（L-valine，支链氨基酸）是饲料、食品及医药领域的重要原料，其生物合成以前体丙酮酸（pyruvate）为起点。传统好氧发酵虽利于菌体生长，但三羧酸循环（Tricarboxylic Acid cycle, TCA cycle）大量消耗丙酮酸，导致葡萄糖至L-valine的理论得率（65%）难以达到，现有报道得率普遍偏低（常低于50%）。两阶段（好氧-限氧/厌氧）发酵虽可部分抑制TCA循环，但仍存在发酵周期长、好氧阶段丙酮酸浪费等问题。因此研究人员拟开发单阶段限氧发酵工程菌株，通过协同适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）与组学指导的反向代谢工程，减少副产物生成并平衡辅因子（NADH/NAD⁺、ATP），实现L-valine的高效合成。

主要关键技术方法

以实验室前期构建的L-valine生产菌株VAL0（Escherichia coli MG1655背景，敲除lacI、ldhA、adhE、pflB、frdABCD并强化ilv操纵子及brnFE转运）为起始菌株。采用CRISPR/Cas9系统（pREDCas9/pGRB）进行基因敲除与基因组整合；依次敲除乙酸合成途径基因poxB、ackA、tdcD、pta并强化糖酵解（glycolysis）关键基因gapA与pgk构建ALE适配底盘VAL06。以密封试剂瓶建立限氧环境，对VAL06进行两轮连续传代ALE筛选获得优良进化株ALE2-40。对VAL06与ALE2-40进行比较基因组测序与限氧条件下转录组（RNA-seq）分析，锁定有益突变与差异表达基因。基于组学结果在ALE2-40上进行反向代谢工程：敲除转录组下调有利基因（rsxE、fimG、yjiG、speC），并用生长偶联启动子P_fliC调控aceE表达，获得最终菌株VAL19。通过摇瓶及5 L生物反应器进行限氧补料分批发酵，测定生物量（OD₆₀₀）、L-valine及副产物、胞内NADH/NAD⁺比值、ATP含量及PDH活性。

研究结果

3.1. Metabolic engineering of the starting strain to build a suitable chassis for adaptive evolution under oxygen-limited conditions

研究人员依次敲除poxB、ackA、tdcD、pta（菌株VAL01–VAL04），乙酸积累逐步降至1.5 g/L（降低71.2%），L-valine升至42.2 g/L。进一步在VAL04中分别过表达pgk（VAL05）与gapA（VAL06），其中gapA过表达使L-valine提高6.0%至44.5 g/L，胞内NADH/NAD⁺升高，证实增强糖酵解NADH补给有利于限氧下L-valine合成。选定VAL06为ALE出发菌株。

3.2. Adaptive laboratory evolution of VAL06 under oxygen-limited condition

对VAL06进行两轮限氧ALE，初轮获优良株ALE1-45，次轮获ALE2-40。摇瓶验证ALE2-40限氧下OD₆₀₀达22.6、L-valine达51.8 g/L，优于出发株及ALE1-45，表明ALE有效提升了限氧适应性与生产性能。

3.3. Fermentation assessment of the evolved strain in a 5-L bioreactor

5 L生物反应器限氧补料分批发酵中，ALE2-40 28 h产L-valine 85.4 g/L，葡萄糖得率58.0%，较VAL06（78.5 g/L，55.9%）显著提升，且无乙酸等副产物积累，证明单阶段限氧发酵可行且周期缩短至28 h。

3.4. Comparative genomic analysis between the evolved strain and the starting strain

全基因组比对发现ALE2-40含4个SNV：lpd（G961A，编码硫辛酰胺脱氢酶 lipoamide dehydrogenase，PDH复合体组分）、yfdH（T743C）、rplP（A217C）、fimH（G259T）。质粒回补验证显示lpd^A321T与yfdH^I248T过表达提升L-valine最显著。PDH活性检测表明ALE2-40及VAL06-lpd*较VAL06分别提高约70.8%与70.6%，lpd突变降低了PDH对高NADH的抑制敏感性，改善限氧时丙酮酸代谢与NADH平衡。

3.5. Comparative transcriptomic analysis between the evolved strain and the starting strain

转录组显示ALE2-40与VAL06共有17个持续差异表达基因，其中上调基因ybcL、yihA、napF与下调基因rsxE、speC、yjiG、argI、fimG有利于L-valine合成。在VAL06中过表达ybcL、yihA、napF（ybcL效果最明显）或在ALE2-40中敲除上述下调基因均提高L-valine。胞内检测显示ALE2-40的NADH/NAD⁺为VAL06的3.44倍；ΔrsxE与ΔyjiG显著提升NADH/NAD⁺，ΔfimG与ΔspeC大幅提升ATP（分别升188.8%与91.3%），表明这些靶点通过富集NADH池和节约ATP促进合成。

3.6. Transcriptomics-guided reverse metabolic engineering

在ALE2-40中进一步过表达已上调基因无增益甚至损害代谢平衡。逐步组合敲除下调基因获VAL12（ΔrsxE）、VAL13（ΔrsxE ΔfimG）、VAL17（VAL13 ΔyjiG）、VAL18（VAL17 ΔspeC），其中VAL18摇瓶L-valine 38.6 g/L，得率55.2%，NADH/NAD⁺、PDH活性及ATP较ALE2-40分别升70.0%、74.3%、53.5%。用生长偶联启动子P_fliC替换aceE（编码PDH E1亚基）原生启动子得VAL19，适度降低稳定期PDH活性并略减后期生物量，更利于碳流向L-valine。

3.7. Fed-batch fermentation of the engineered strains in a 5-L bioreactor under oxygen-limited conditions

VAL19在5 L限氧补料分批发酵28 h产L-valine 93.7 g/L，葡萄糖得率60.4%（理论得率65%的92.9%），产率3.35 g/L/h，优于VAL18（90.6 g/L，59.2%）及ALE2-40（85.4 g/L），为目前已报道E. coli产L-valine最高得率与产率。

讨论与结论总结

讨论指出限氧ALE使菌株获得更好生长与L-valine得率，关键突变为lpd^A321T解除NADH对PDH抑制并提升NADH可用性。转录组揭示多个NADH/ATP关联靶点，其单独或组合敲除协同提升辅因子水平，但需平衡而非过度升高。用P_fliC动态调控aceE实现生长与生产部分解耦。研究表明ALE结合理性反向工程可有效构建高性能细胞工厂，未来可通过引入异源ATP生成或优化NADH再生进一步提升。

结论：研究人员通过乙酸途径阻断与gapA过表达构建ALE底盘，经限氧ALE获进化株ALE2-40，组学分析鉴定lpd突变及多个NADH/ATP相关下调基因，据此反向工程最终菌株VAL19在限氧下单阶段发酵28 h产L-valine 93.7 g/L、葡萄糖得率60.4%、产率3.35 g/L/h，为迄今E. coli产L-valine最高得率，为以丙酮酸为前体的类似化学品工程菌构建提供借鉴。