RAFT衍生的周期性糖聚合物在金表面的固定化用于定量糖-蛋白质相互作用分析

《Surfaces》：Immobilization of RAFT-Derived Periodic Glycopolymers on Gold Surfaces for Quantitative Glycan–Protein Interaction Analysis

　　

为了理解生物界面上的糖-蛋白质相互作用，设计具有结构控制糖修饰的表面非常重要。特别是，天然存在的糖胺聚糖（GAGs）具有周期性的糖排列，在蛋白质识别中发挥重要作用，这凸显了开发可作为GAG模拟物用于定量相互作用分析的周期性糖聚合物模型系统的必要性。在本研究中，研究人员通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成了序列控制的周期性糖聚合物，并将其固定到金表面上以构建糖修饰界面。所合成的材料是一种末端功能化的周期性糖聚合物，具有最基础的结构，由交替的含麦芽糖乙烯基醚（MalVE）单元和乙基马来酰亚胺（EtMI）单元组成，在ω-末端有一个三硫代碳酸酯基团。该三硫代碳酸酯基团被转化为巯基，通过金-硫（Au-S）键形成进行固定化。通过¹H核磁共振（NMR）波谱、尺寸排阻色谱（SEC）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和紫外-可见（UV-vis）光谱的结构表征确认了结构符合设计。石英晶体微天平（QCM）测量验证了巯基封端周期性糖聚合物在金表面的稳定固定化，并可估算接枝密度以及定量分析修饰界面上的糖-蛋白质相互作用。与牛血清白蛋白（BSA）相比，周期性糖聚合物修饰的表面表现出对刀豆蛋白A（ConA）的选择性结合行为，表观结合常数在10⁶–10⁷ L mol^?1范围内。这种增强的结合行为表明，沿主链周期性侧基麦芽糖残基上也发生了特异性和多价的蛋白质相互作用。这些结果表明，用RAFT聚合合成的端基功能化周期性糖聚合物修饰的金表面为糖-蛋白质相互作用的定量分析提供了一个通用平台，并提示了周期性糖聚合物作为功能材料的潜在应用。

**论文解读文章**

研究背景方面，糖-蛋白质相互作用（如碳水化合物-凝集素和宿主-病原体相互作用）在生物识别过程中至关重要，也与生物传感和生物分子界面材料的设计高度相关。天然糖胺聚糖（GAGs）具有周期性结构，通过选择性相互作用调控多种生物学功能。尽管已有研究合成多组分糖聚合物并探索糖链序列对蛋白质识别的影响，但将具有交替或周期性糖侧基排列的糖聚合物固定在固体基底（尤其是金表面）上的研究极少。因此，在周期性糖聚合物形成的界面上开展糖-蛋白质相互作用的定量分析仍不明确。为填补这一空白，研究人员开展了本研究，旨在建立一种原型周期性糖聚合物（GAG模拟物的最基础结构）的合成与固定方法，并验证其定量分析糖-蛋白质相互作用的可行性。

研究人员通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成了序列控制的周期性糖聚合物——聚(MalVE-alt-EtMI)，其侧链麦芽糖残基沿主链交替排列。随后，将聚合物末端的三硫代碳酸酯基团还原为巯基，通过形成金-硫（Au-S）键将其固定到金表面。利用石英晶体微天平（QCM）监测固定化过程并定量分析糖-蛋白质相互作用。研究得出以下结论：所合成的周期性糖聚合物具有明确的交替结构和可控的分子量；巯基端基修饰的聚合物可在金表面稳定固定，接枝密度可控；该修饰表面能选择性结合刀豆蛋白A（ConA），表观结合常数达10⁶–10⁷ L mol^?1，体现出多价增强效应。这项工作为构建GAG模拟物的定量分析平台提供了新策略，论文发表在《Surfaces》杂志上。

**关键技术方法**：本研究主要采用了以下关键技术方法：（1）可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，用于合成序列控制的周期性糖聚合物，实现分子量和端基的精确控制；（2）NaBH₄还原法，将聚合物ω-末端三硫代碳酸酯基团转化为巯基端基，实现金表面固定化；（3）石英晶体微天平（QCM）技术，监测固定化过程、估算接枝密度并定量分析糖-蛋白质相互作用（包括结合常数计算）；（4）结构表征手段：¹H核磁共振（NMR）波谱、尺寸排阻色谱（SEC）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和紫外-可见（UV-vis）光谱，用于确认聚合物结构、分子量分布及端基转化效率。

**研究结果**：

**3.1 聚(MalVE-alt-EtMI)-TC的合成与表征**：通过RAFT共聚合，以三硫代碳酸酯型RAFT试剂（BTSE）为链转移剂，VA-044为引发剂，在水/乙腈混合溶剂中合成了周期性糖聚合物。SEC分析显示单峰分布，分子量随单体转化率增加而增加，¹H NMR确认了交替结构（MalVE与EtMI单元比例接近1:1）。MALDI-TOF质谱中观察到对应于MalVE和EtMI重复单元的交替质量增量，直接证实了序列控制。UV-vis光谱显示三硫代碳酸酯端基的保留率约为89%，表明端基功能化高效。

**3.2 巯基封端聚(MalVE-alt-EtMI)在金基底上的固定化**：通过NaBH₄还原三硫代碳酸酯端基，UV-vis光谱显示在307 nm处吸收峰消失，还原效率超过90%。QCM监测显示，引入聚合物溶液后频率迅速下降，约500 s内达到稳定，表明通过Au-S键形成了稳定的固定层。对于不同分子量（M_n = 7,900、18,300、24,800）的聚合物，固定量分别为85 ± 9、116 ± 6和113 ± 10 ng cm^?2，说明固定化主要由端基巯基决定，链长影响较小。

**3.3 周期性糖聚合物修饰表面的糖-蛋白质相互作用分析**：以ConA（识别麦芽糖残基）为模型蛋白，BSA为非特异性对照。QCM实验显示，ConA加入后频率显著下降（Δf），BSA仅引起微小变化，表明选择性结合。对聚(MalVE-alt-EtMI)-SH_18.3k样品进行定量分析，通过逐步加入不同浓度ConA（20–400 nmol L^?1）得到结合等温线，采用Langmuir吸附模型（Steck–Wallach方程）拟合，表观结合常数K_a为5.8 × 10⁶ L mol^?1。三种分子量的聚合物K_a值均在10⁶–10⁷ L mol^?1范围，显著高于单分子麦芽糖-ConA相互作用（约10³ L mol^?1），体现了多价效应。

**总结讨论部分**：研究结果表明，周期性糖聚合物修饰的金表面能实现选择性增强的糖-蛋白质相互作用。模型系统中ConA的选择性结合主要归因于化学识别（麦芽糖残基与ConA的相互作用），而非高度特异性的空间序列识别。所建立的方法为评估糖聚合物的化学结构、周期性排列、表面密度和链构象对界面蛋白质/凝集素结合的影响提供了基础。未来将固定带有两种不同侧基糖的交替糖聚合物（更高级GAG模拟物），定量研究周期性糖展示如何影响蛋白质结合选择性，以开发用于选择性生物分子识别和生物传感的糖聚合物修饰金传感器芯片。

**研究结论部分翻译**：通过RAFT聚合合成了一种由交替的含麦芽糖乙烯基醚和乙基马来酰亚胺单元组成的序列控制周期性糖聚合物，作为受糖胺聚糖（GAG）结构启发的原型周期性糖聚合物。结构分析确认了具有受控分子量、周期性单体排列和高效三硫代碳酸酯端基嵌入的明确交替糖聚合物。随后将末端三硫代碳酸酯基团转化为巯基，通过Au-S键实现金表面固定化。QCM测量确认了周期性糖聚合物在金表面的稳定固定化。以刀豆蛋白A（ConA）为模型糖结合蛋白，定量评估了周期性糖聚合物修饰表面的选择性糖-蛋白质相互作用。表观结合常数估计在10⁶–10⁷ L mol^?1范围内，表明界面多价糖展示增强了糖-蛋白质相互作用。此外，聚合物表面密度与结合行为之间的关系提示，不仅糖密度，空间排列和聚合物链构象也影响界面生物分子识别。在本模型系统中，ConA相对于BSA的选择性结合主要归因于ConA与麦芽糖残基之间的化学识别，而非高度特异性的空间序列识别。然而，本研究建立的方法论为评估糖聚合物的化学结构、周期性排列、表面密度和链构象如何影响界面蛋白质或凝集素结合提供了有用基础。在未来的研究中，固定带有两种不同侧基糖的交替糖聚合物（作为更高级GAG模拟结构设计），将能定量研究周期性糖展示如何影响蛋白质结合选择性。此类研究可能有助于开发用于选择性生物分子识别和生物传感的糖聚合物修饰金传感器芯片。