阴离子Cy5蛋白荧光纳米探针中的电荷转移调控技术，助力精准胰腺癌手术及有效抑制癌细胞转移

《Biomaterials》：Charge Transfer Modulation in Anionic Cy5-Protein Afterglow Nanoprobe Enables Precise Pancreatic Cancer Surgery and Efficient Metastasis Inhibition

　　何海峰|徐立|张志鹏军|黄慧玲|周雷|李哲|刘鸿文中国湖南省长沙市湖南师范大学化学与化工学院化学生物学与中药研究重点实验室，邮编410081摘要活性氧介导的余辉探针因其较高的信噪比和内在的光动力活性，在癌症诊疗领域具有巨大潜力。然而，以往的ROSAF探针通常需要纳米载体才能递送至肿瘤，且存在因泄漏导致的信号失真以及在缺氧肿瘤中因缺氧而失去功效的问题。在此，我们基于SOCT-ISC原理，通过合理引入强吸电子性的介位取代基，对阴离子型五甲炔花青素（ACy5）的负电荷转移进行了调控。优化后的ROSAF探针ACy5-NPy的吸收/发射波长相比传统Cy5红移了110纳米，并且能够稳定结合血清白蛋白（SA）。当与SA结合后，ACy5-NPy会转化为一种高效的I型ROSAF纳米探针（ACy5-NPy@BSA），即使在缺氧条件下，其余辉强度也比单体形式高出27.7倍。由于不依赖氧气且具有天然的肿瘤靶向性，ACy5-NPy@BSA能够在30分钟内实现对胰腺肿瘤的高对比度余辉成像，信噪比可达33.3，同时还能精准界定肿瘤边界。这为精准的手术导航和彻底切除肿瘤提供了可能，即便是在多发性肿瘤中，也能在24天内防止肿瘤复发。此外，该探针还能通过激活焦亡作用实现高效的光动力疗法，显著抑制胰腺肿瘤的生长和转移，这一效果也体现在血清中癌症标志物水平的下降上。通过对负电荷转移的系统性调控，我们首次制备出了蛋白质类余辉纳米探针，为癌症诊疗中的余辉探针设计提供了新策略。引言余辉成像技术可以检测辐射后由持续存在的化学或晶格缺陷所发出的光子，从而避免传统荧光成像中常见的自荧光干扰。[1], [2], [3]其机制基于能量储存后再逐步释放，因此无需在生物成像过程中持续激发光源，大大减少了内源性荧光团带来的背景干扰，使得体内成像的信噪比得以提升。[4], [5], [6], [7]近年来，具有更好生物相容性的有机余辉试剂越来越受到关注。尤其是活性氧介导的余辉探针，在生物成像领域展现出了巨大潜力。[8]这类探针通常依靠光敏剂——可以是内在的[5], [9], [10], [11], [12], [13]，也可以是外部添加的[14], [15]——在光照作用下产生活性氧。这些活性氧进一步反应生成高能中间体，其分解过程中释放出的化学能量会激发发光物质，从而产生余辉。目前的ROSAF探针主要基于半导体聚合物纳米粒子或有机分子。[2]虽然半导体聚合物纳米粒子由于具有两亲性聚合物结构而便于被细胞摄取，但它们往往存在成分泄漏的问题，从而导致信号不稳定且生物相容性较差。因此，最近的研究致力于开发小分子型的余辉试剂，尤其是可被生物标志物激活的II型光敏剂，这类光敏剂具有更好的结构可调控性且毒性更低（图1a）。[9], [10], [11], [12], [13]不过，仍存在一些关键挑战。诸如胰腺癌这类被称为“癌症之王”的恶性肿瘤所处的极度缺氧微环境，会限制基于II型光敏剂的ROSAF探针的效能。[16]尽管已经有一些I型ROSAF探针被研究出来，但由于缺乏合理的分子设计策略，其发展仍然面临阻碍。此外，现有的小分子余辉试剂往往缺乏针对肿瘤的特异性，还容易发生非特异性积累。[17]更重要的是，大多数ROSAF探针的水溶性较差，还存在因聚集而导致的发光减弱现象，而短寿命的活性氧（如1O2、O2•-和•OH）在水环境中极为不稳定。[18]所有这些问题都影响了余辉的产生，进而限制了其在癌症成像中的应用。因此，开发出新型、亮度更高且具有更强肿瘤靶向能力的试剂，是该领域亟需解决的重要问题。血清白蛋白是生物系统中的一种重要运输蛋白，人们已将其策略性地用于提高化疗药物对肿瘤的靶向递送能力，从而在增强疗效的同时减少对正常组织的损伤。[19], [20], [21], [22]它的良好生物相容性可以降低合成化合物的毒性，例如获批上市的纳布帕卡利轴素就是这一特性的体现。[23]重要的是，由于其具有疏水且富电子的微观环境，血清白蛋白可以为光敏剂提供理想的保护环境，同时有利于电子转移，宋等人就利用牛血清白蛋白作为“电子储备库”来促进I型光动力疗法的发展。[24]正是基于这些特性，血清白蛋白成为构建高效蛋白质类余辉试剂的理想候选物质。据此，我们提出了一种新策略：开发用于癌症诊疗的光敏剂-血清白蛋白复合物。之前的研究已经将基于花青素的探针通过共价或非共价方式固定在血清白蛋白上，从而推动了生物成像和生物传感技术的发展。[19], [20], [21], [25]花青素染料以其优异的光学性能、良好的水溶性和高度的结构可塑性而广受认可。[26], [27]某些带有介位取代基的Cy5衍生物，当与自旋轨道电荷转移跨系统跃迁相结合时，可充当高效的II型光敏剂。[28], [29], [30], [31], [32]最近，我们的团队开发出一种两性离子型的Cy5-NF，它可以通过超氧化物引发的分子内级联反应实现肾脏清除并产生余辉。[9]然而，虽然延长多甲炔链是一种使吸收/发射波长红移的常见方法，但这会增加其在光动力过程中产生的活性氧（主要是1O2、O2•-和•OH）作用下的降解风险。[33], [34]正是这种固有的不稳定性，导致基于Cy7或更长链花青素的高效ROSAF探针极为罕见，因为要获得最佳的余辉效果，就需要精心平衡它们的氧化性以及产生活性氧的能力。此外，目前基于Cy5的ROSAF探针具有良好的水溶性，这不利于它们与非共价方式与血清白蛋白结合（因为无法通过共价方式固定），从而限制了它们在肿瘤中的特异性积累，也让其余辉容易受到水环境的抑制。这些局限性凸显出有必要开发一类全新的阴离子型花青素染料基蛋白质余辉试剂，这类试剂应具有更长的吸收/发射波长，并且能够通过负电荷转移调控实现与血清白蛋白的结合。在此，我们通过对阴离子型五甲炔花青素基于的负电荷转移进行系统性调控，设计并合成了几种具有潜在余辉特性的小分子有机化合物（图1b）。与阳离子型五甲炔花青素相比，带有强吸电子性三氰呋喃端基的ACy5，其负电荷会在多甲炔链上发生离域，从而使吸收/发射光谱发生红移。[35], [36]不幸的是，由于缺乏可行的设计策略，基于ACy5的光敏剂开发工作一直进展缓慢，直到李等人通过调控纳米粒子内的分子聚集情况来促进1O2的产生，从而制得了高效的基于ACy5的光敏剂。[37], [38]由于ACy5带有负电荷，预计它不会与富含负电荷的血清白蛋白结合。因此，为了开发出具有稳定血清白蛋白结合能力的基于ACy5的光敏剂，我们在ACy5的介位位置引入了一个阳离子吡啶inium基团，以此调整其负电荷，并形成几乎正交的激发态结构。这一策略利用了从局部激发态到电荷转移态时的角动量守恒规律，从而促进了SOCT-ISC过程的进行。[39], [40], [41], [42]通过逐步增强取代基的吸电子能力，我们既提升了通过负电荷转移促进的活性氧生成量，又提高了通过静电作用、疏水作用以及非共价的离子-π相互作用实现的与血清白蛋白的结合亲和力。最终我们得到了ACy5-NPy，这是一种经过双吡啶inium修饰的衍生物，它在两个方面都表现出更优异的性能，因此成为一种理想的混合型I/II型ROSAF探针，具有很强的与血清白蛋白的结合能力。通过将ACy5-NPy与血清白蛋白结合，我们制得了一种稳定的蛋白质余辉探针ACy5-NPy@BSA。实验结果表明，血清白蛋白的结合显著增强了活性氧的生成。同时，血清白蛋白还起到了“电子储备库”和疏水保护层的作用，使得光动力机制从混合型I/II型转变为纯I型，进而大幅提升了余辉性能。这种不依赖氧气的机制使得ACy5-NPy@BSA非常适合用于胰腺癌等缺氧恶性肿瘤的余辉成像（图1c）。与ACy5-NPy相比，即使在缺氧条件下，ACy5-NPy@BSA产生的总活性氧量也增加了2.8倍，O2•-的产量则增加了5.8倍。在750纳米激光照射后，其在体外 的余辉强度提升了27.7倍。考虑到胰腺癌严重的缺氧状况和高代谢需求，这种蛋白质余辉探针能够在5分钟内快速在肿瘤部位积累，30分钟后浓度达到稳定状态，从而能够清晰地显示多个肿瘤病灶。余辉成像的信噪比达到了33.3，而荧光成像的信噪比为11.1，这一数值足以实现清晰的肿瘤边界界定。在单发和双发胰腺肿瘤的小鼠模型中，借助余辉引导进行的手术能够实现完全切除，且在24天内没有肿瘤复发（这一点已通过H&E染色得到证实），而依靠荧光引导的手术则会导致肿瘤切除不彻底，且术后很快就会出现肿瘤复发。利用其不依赖氧气的活性氧生成特性，ACy5-NPy@BSA还被用于胰腺癌的全身光动力疗法。这种治疗通过光动力疗法诱导的免疫激活作用，显著抑制了肿瘤的生长和转移，这一效果从血清中癌症标志物CA19-9、CEA和CA125水平的显著下降中得到了印证。通过调控负电荷转移，我们成功构建出了这种蛋白质余辉试剂，它为高度免疫抑制性的胰腺癌的精准诊断和治疗提供了有效工具，同时也为余辉探针的设计和开发提供了一种新的思路。章节节选基于I型ROSAF的蛋白质余辉探针的设计与合成手术切除和转移控制是胰腺癌治疗中的关键环节。[16], [43], [44]基于I型活性氧的余辉成像技术，尤其是与光动力疗法诱导的免疫激活相结合时，为在缺氧的肿瘤微环境中实现精准的肿瘤定位和转移抑制提供了有力手段。[45], [46]不过，这类探针的合理设计仍然面临诸多挑战。ROSAF探针的余辉性能取决于……结论本研究通过系统性调控阴离子型花青素染料中的负电荷转移，建立了一种构建蛋白质类余辉诊疗试剂的合理设计策略。由此得到的探针ACy5-NPy@BSA克服了传统II型ROSAF系统的诸多缺陷，比如依赖氧气才能发挥作用以及必须依靠合成纳米载体，而这些缺陷往往会导致其在缺氧肿瘤中的疗效不佳，同时还可能存在安全风险。通过引入强吸电子性的取代基，该探针解决了这些问题。方法不同活性氧生成量的测定。除非另有说明，活性氧生成量的测定均遵循以下规则：对于检测水中相应化合物产生的1O2，采用ABDA作为检测指标。具体操作为将染料（5 μM）和ABDA（100 μM）混合在水中，然后在750纳米激光照射（功率为0.2 W/cm2）下，每2分钟进行一次吸收光谱检测。而对于其他活性氧种类的检测，则采用SOSG作为检测指标。具体操作为将染料（2 μM）和SOSG（20 μM）混合在一起。CRediT作者贡献声明周雷：实验验证、项目管理、方法学研究。李哲：论文撰写与修改、初稿撰写、课题指导、数据整理、概念构思。刘鸿文：论文撰写与修改、初稿撰写、课题指导、资金获取、概念构思。徐立：项目管理、方法学研究、资金获取、正式数据分析、数据整理。何海峰：初稿撰写、实验验证、方法学研究、正式数据分析、数据整理。黄慧玲：数据可用性说明本研究的主要数据均包含在论文及其补充材料中。如有需要，相关原始数据可向相应作者索取。本文同时附有数据源文件。利益冲突声明作者声明不存在任何竞争性利益。利益冲突申报作者声明自己没有可能影响本文研究结果的已知竞争性财务利益或个人关系。致谢本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22474036和22405172）、上海交通大学医学院新华医院（项目编号2024BS04）以及湖南省自然科学基金（项目编号2025JJ40014和2026JJ30157）的支持。作者们衷心感谢湖南大学的张晓兵教授在实验过程中给予的无私帮助。