《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Atlantic to Pacific: Outbreak of bivalve transmissible neoplasia detected in hybridizing soft-shell clams and eDNA in Puget Sound
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双壳类可传播性肿瘤（BTNs）是一种在多种双壳类物种中出现的可传播性癌症，包括北美东海岸的东部软壳蛤（Mya arenaria）种群。一个单一克隆（称为MarBTN）的两个亚谱系目前在美国新英格兰和加拿大爱德华王子岛以低度地方性流行水平（1%至5%）传播，但此
双壳类可传播性肿瘤（BTNs）是一种在多种双壳类物种中出现的可传播性癌症，包括北美东海岸的东部软壳蛤（Mya arenaria）种群。一个单一克隆（称为MarBTN）的两个亚谱系目前在美国新英格兰和加拿大爱德华王子岛以低度地方性流行水平（1%至5%）传播，但此前未在西海岸的软壳蛤中观察到MarBTN。2022年，研究人员在华盛顿州普吉特湾采集了软壳蛤，意外地在两个地点发现了MarBTN。在随后的年份中，这两个地点的患病率持续上升，到2024年均超过75%，而在其他种群中仍无法检测到，这表明一场严重的疾病爆发正处于早期阶段。基于仅在美国亚谱系中发现的体细胞转座子插入位点的存在，该癌症很可能最近是从新英格兰移植而来。研究人员还发现，普吉特湾多个地点的软壳蛤是M. arenaria和M. japonica的杂交种群。M. japonia可能对该癌症的易感性较低，尽管需要进一步采样来证实这一假设。研究人员进一步开发了一种灵敏的环境DNA（eDNA）检测方法，靶向MarBTN线粒体基因组中的体细胞突变。使用该方法，研究人员调查了普吉特湾的51个地点，在观察到MarBTN阳性蛤的地点及周边区域检测到高水平的癌症。这些结果确定了一场由于疾病从另一大洋转移而导致的杂交种群中可传播性癌症的严重爆发，并证明了eDNA方法在环境中追踪BTN的实用性。
可传播性癌症是一种罕见的癌症类型，其癌细胞能够在个体间直接传播。在双壳类动物中，这类疾病被称为双壳类可传播性肿瘤（BTN），已在包括北美东海岸东部软壳蛤（Mya arenaria）在内的多个物种中发现。MarBTN是软壳蛤中已知的一种BTN谱系，此前仅在东海岸以低流行率（1-5%）存在。然而，近期在北美西海岸华盛顿州普吉特湾的软壳蛤种群中，研究人员意外地检测到MarBTN，且患病率在短期内急剧上升，表明一场严重的疾病爆发正在发生。这项研究旨在确认此次爆发的存在、追溯其来源、评估其在环境中的传播范围，并探究当地软壳蛤种群的杂交状态对疾病易感性的潜在影响。该研究对于理解可传播性癌症的跨洋传播机制、监测其环境扩散以及观察宿主在杂交背景下对癌症的进化响应具有重要意义。相关成果发表于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences）。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过采集普吉特湾多个地点（包括Triangle Cove、Crandall Spit、Stanwood、Similk Bay和Sequim Bay）的软壳蛤样本（2022-2024年），获取血淋巴并进行细胞形态学观察和DNA提取。其次，利用等位基因特异性定量聚合酶链式反应（qPCR）靶向核基因（N1N2基因座附近的Steamer逆转录转座子体细胞插入）来诊断和定量MarBTN。第三，使用针对特定Steamer转座子插入位点的PCR以及线粒体细胞色素c氧化酶I（mtCOI）测序，对西海岸的MarBTN进行基因分型，并与东海岸的美国和加拿大爱德华王子岛亚谱系进行比较。第四，通过扩增核基因延伸因子1α（EF1α）和mtCOI基因座，并利用物种特异性限制性内切酶消化或特异性PCR，对软壳蛤宿主进行基因分型，以鉴定M. arenaria和M. japonica及其杂交状态。最后，开发并应用了一种高灵敏度的环境DNA（eDNA）检测方法，从普吉特湾51个地点采集海水样本，过滤提取eDNA后，使用qPCR靶向MarBTN线粒体基因组中美国亚谱系特有的体细胞单核苷酸变异（SNV），以量化环境中癌细胞的分布。
**研究结果：**
**1. 华盛顿州Triangle Cove和南斯卡吉特湾软壳蛤中BTN爆发的识别与追踪**
2022年，在普吉特湾Triangle Cove采集的蛤中，45%（27/60）个体血淋巴出现异常细胞形态，符合弥散性肿瘤（DN）特征。通过qPCR证实为MarBTN。在附近的Stanwood地点也检测到MarBTN（13%，5/39）。2023年和2024年的后续采样显示，这两个地点的MarBTN患病率持续上升：Triangle Cove从32%（16/50）升至81%（22/27），其中30%个体血淋巴癌细胞比例超过10%；Stanwood从37%（11/30）升至77%（51/66），39%个体为重度感染。而在其他三个地点（Crandall Spit、Similk Bay、Sequim Bay）的所有年份样本中均未检测到异常细胞或癌症DNA。
**2. 分子分析表明普吉特湾蛤中的癌症来自美国东海岸**
对西海岸MarBTN样本进行转座子插入位点特异性PCR分析显示，其扩增模式与美国东海岸的MarBTN美国亚谱系高度一致，而与加拿大爱德华王子岛亚谱系不同（例如，西海岸样本均缺失一个美国特异性插入位点IMNYTCC9c2R）。线粒体mtCOI基因测序也证实西海岸样本序列与美国亚谱系相同。这些结果表明，普吉特湾的MarBTN很可能近期从新英格兰地区传播而来。
**3. 在华盛顿州普吉特湾检测到M. arenaria和M. japonica软壳蛤的杂交种群**
对采集的所有软壳蛤进行核基因EF1α和线粒体mtCOI基因座分型发现，普吉特湾同时存在M. arenaria和M. japonica两个物种。在一些种群（如Stanwood和Triangle Cove）中以M. arenaria为主，而在其他地点则以M. japonica为主或两者混合。研究发现广泛的杂交证据，包括在核基因座出现杂合子（M. arenaria/M. japonica）以及核与线粒体基因型不一致的个体。对两个无MarBTN的地点（Crandall Spit和Similk）的种群分析表明，EF1α基因座的等位基因不符合哈代-温伯格平衡，且核与线粒体基因座之间存在显著的连锁不平衡，表明物种间仍存在一定的杂交障碍。在Triangle Cove，携带M. arenaria基因的蛤中MarBTN患病率有更高趋势，但差异未达到统计学显著性。
**4. 对Triangle Cove环境DNA的高灵敏度线粒体qPCR显示癌细胞在海水中的局部扩散**
研究人员开发了靶向MarBTN线粒体基因组体细胞SNV的qPCR方法，用于检测海水eDNA。在Triangle Cove入口及周边海域的采样显示，海湾入口处的海水中MarBTN特异性DNA浓度最高（达406拷贝/毫升），随着距离增加而降低，但在最远2.8公里处仍可检测到（51拷贝/毫升）。相比之下，靶向所有M. arenaria线粒体DNA的对照引物在离海湾较远的一些位点显示出更高的扩增水平。
**5. 通过eDNA检测显示MarBTN在整个普吉特湾的扩散**
2023-2024年对普吉特湾50个地点的广泛eDNA调查显示，在大多数近岸地点都能检测到软壳蛤eDNA。MarBTN特异性DNA在Triangle Cove和Stanwood及其以北的斯卡吉特湾、以南的Port Susan以及西南部的惠德比岛等多个地点被检测到，最高浓度达735拷贝/毫升。值得注意的是，检测到MarBTN的区域与M. arenaria线粒体DNA占主导的区域重合，而在M. japonica线粒体DNA占主导的区域则未检测到MarBTN。不同eDNA处理方法（立即过滤干燥、先冷冻后过滤、用Longmire‘s溶液保存滤膜）的比较显示，立即过滤干燥并使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取的方法产量最高，但不同方法间结果差异约2倍。
**讨论与结论：**
本研究通过蛤血淋巴分析和灵敏的eDNA检测，报告了美国西海岸软壳蛤中MarBTN的爆发，该种群此前被认为未暴露于该疾病。多种遗传标记证实，西海岸的MarBTN与先前仅在东海岸美国发现的亚谱系关系最密切。缺乏既往检测记录、患病率快速上升以及影响地理区域有限，均强烈提示该疾病是近期从东海岸移植到西海岸的。MarBTN的远距离转移很可能源于人类活动（如感染蛤的移植或含有癌细胞的海水意外转移），但具体机制尚不明确。值得注意的是，这是继MtrBTN2谱系之后，第二例因人类活动导致BTN传播至新大洋的案例。
尽管西海岸MarBTN与东海岸美国亚谱系几乎相同，但所有西海岸样本都缺失一个Steamer转座子插入位点，这可能代表一个早期分支或该位点的丢失。此外，在加拿大爱德华王子岛Savage Harbour采集的新样本可能代表一个先前未表征的癌症亚谱系。这些结果表明，循环中的可传播性癌细胞存在比已知更多的基因组多样性。
历史上，东海岸曾发生过严重的DN爆发（患病率高达90%），并导致种群大量死亡，而目前该疾病在东海岸所有已知种群中以低水平持续存在。预计西海岸的此次爆发可能遵循类似模式：初期导致显著死亡和种群损失，随后选择出更具抗性的蛤，最终疾病在种群中以地方性流行状态维持。商业捕捞活动因该地区蛤大量死亡而被迫停止的轶事观察支持了这一预测。
研究证实了M. arenaria和M. japonica在MarBTN爆发区的杂交。尽管趋势不显著，但观察发现携带M. japonica基因的蛤MarBTN患病率可能较低，且eDNA检测显示MarBTN仅出现在M. arenaria线粒体DNA主导的区域。如果M. japonia确实对MarBTN的易感性较低，那么杂交可能导致抗癌保护性等位基因在受影响种群中发生基因渗入。MarBTN已被证明是致死性的，预计将在混合种群中引发保护性等位基因的选择性清除。需要进一步的基因组分析来确定杂交程度以及是否存在来自M. japonia的保护性等位基因。
本研究展示了eDNA采样在检测野生海水样本中可传播性癌症方面的效用，并绘制了相关蛤种群的分布图。eDNA结果揭示了此次爆发已超出最初通过个体蛤诊断确定的区域，但同时也表明目前仅有一小部分普吉特湾软壳蛤种群受到影响，爆发区两侧似乎还存在多个尚未受MarBTN影响的大型种群。eDNA方法对于未来观察疾病在环境中的动态、追踪其沿海扩散以及研究环境变量与疾病关联至关重要。在测试的方法中，立即过滤海水样本、干燥滤膜并使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒提取被确定为监测BTN eDNA的最佳实践方案。
**研究结论：** 此次在普吉特湾杂交软壳蛤种群中发现的严重可传播性癌症爆发，源于从大西洋到太平洋的疾病转移。研究人员开发的灵敏环境DNA（eDNA）方法能够有效追踪癌症在环境中的传播。该爆发为实时观察杂交野生种群对可传播性癌症的抗性进化提供了独特机会。
