《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Gestational exposure to multiple elements and maternal liver function: epidemiological evidence and computational AOP analysis
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环境元素具有毒性作用与生理作用双重属性，是普遍存在的环境暴露。然而，关于其对妊娠期间母体肝功能的单独及联合影响，以及潜在生物学机制的证据仍然有限。本研究纳入了无锡出生队列的620名孕妇，检测了母体血液中20种元素及11项肝功能指标的含量。研究人员采用广义线性模
环境元素具有毒性作用与生理作用双重属性，是普遍存在的环境暴露。然而，关于其对妊娠期间母体肝功能的单独及联合影响，以及潜在生物学机制的证据仍然有限。本研究纳入了无锡出生队列的620名孕妇，检测了母体血液中20种元素及11项肝功能指标的含量。研究人员采用广义线性模型（Generalized Linear Model, GLM）和广义可加模型（Generalized Additive Model, GAM）评估单一元素与肝功能指标之间的关联；通过分位数g计算（Quantile g-computation, Qgcomp）和加权分位数和（Weighted Quantile Sum, WQS）回归评估混合物效应；并进一步检验了元素间的交互作用与联合效应，同时构建了不良结局路径（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架以探索潜在的机制通路。在20种检测元素中，13种元素的检出率高于70%。单一元素分析发现，锰（Mn）、铅（Pb）、汞（Hg）、钴（Co）、镉（Cd）和硒（Se）与多种肝酶水平呈正相关，而锶（Sr）和钛（Ti）与肝功能指标呈负相关。Qgcomp和WQS分析一致表明，元素混合物与多种肝功能指标，特别是丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH），存在正相关关系。在多项肝功能指标中观察到Sr与Hg之间存在显著的交互作用。此外，计算AOP分析提示，选定元素的暴露可能通过激活肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）-核因子-κB（Nuclear Factor-kappa B, NF-κB）信号通路，在机制上与肝功能障碍相关联。研究结论认为，本研究整合流行病学证据与计算AOP分析，表明妊娠期元素混合物暴露可能与母体肝功能指标的改变相关；Sr与肝功能指标呈负相关，并可能修饰妊娠期元素暴露（特别是Hg暴露）与肝功能之间的关联。
妊娠是女性独特的生理时期，伴随复杂的激素与代谢适应。在此期间，母体肝脏在维持母胎稳态中发挥关键作用，但这些适应性变化也可能显著增加肝胆疾病的易感性，使肝脏更易受到代谢和毒理学损伤。流行病学研究表明，中国约9.6%的孕妇在妊娠期出现肝功能异常，而肝功能受损与急性脂肪肝、子痫前期、早产等不良妊娠结局相关，严重时甚至可导致母婴死亡。因此，识别母体肝功能障碍的危险因素对于改善母婴健康结局至关重要。
现有研究主要关注妊娠特异性肝病、病毒感染、代谢紊乱、肥胖及既往肝病等已确立的危险因素，但这些因素并不能完全解释孕妇群体中常见的肝功能指标轻度升高现象。越来越多的证据表明环境因素对肝功能障碍具有重要贡献，其中环境元素因其广泛分布和环境持久性而受到关注。这些元素通过膳食摄入、饮用水、空气、土壤接触及消费品等多种途径进入人体，包括有毒元素和必需元素两类。成人流行病学证据已证实，砷（As）、铝（Al）、锰（Mn）、镉（Cd）等元素水平升高与肝功能异常风险增加相关，实验研究也证实这些元素可通过氧化应激诱导肝损伤。相比之下，锶（Sr）和钛（Ti）等元素的潜在作用尚未得到充分表征，尽管已有研究提示其可能参与氧化应激调节和炎症反应调控，而这些生物学过程与肝功能改变密切相关。
关于环境元素对孕妇这一脆弱人群肝功能影响的证据仍然有限，这一局限性尤为关键，因为妊娠相关的生理变化可能改变元素的毒代动力学和对肝功能改变的易感性。研究人员此前基于无锡出生队列的研究关注了全氟和多氟烷基物质（Per- and Polyfluoroalkyl Substances, PFAS）混合物与母体肝功能指标的关联，但多种环境元素联合暴露的影响仍需进一步探究。现有证据表明，多种有毒元素联合暴露可能比单一元素暴露产生更强的肝脏相关效应，而某些必需元素如硒（Se）可能通过调节线粒体自噬等机制修饰镉相关肝损伤。然而，大多数研究仅关注单一元素效应或总体混合物效应，而非元素间的潜在交互作用，包括Sr和Ti在内的有毒与必需元素在修饰元素相关肝功能改变中的作用仍不清楚。
为深入理解这一问题，研究人员采用不良结局路径（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架——一种面向机制的环境污染物健康风险评估方法。该框架从分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE）出发，经关键事件（Key Event, KE）直至个体或群体的不良结局（Adverse Outcome, AO），提供了结构化的关联路径。AOP框架已广泛应用于将环境污染物与不良健康结局相联系，如多种元素联合暴露与慢性肾病的关联。针对肝脏相关毒理学结局如肝损伤和纤维化的AOP框架也已建立，但将其应用于多种环境元素联合暴露与肝脏相关结局的研究仍显不足。
基于上述背景，研究人员利用无锡出生队列数据，系统评估了13种共存元素与孕妇11项肝功能指标之间的关联，同时考虑了单一元素效应和混合物效应。研究的重要创新点在于，超越了对元素相关肝功能指标改变的简单表征，进一步检验了某些元素是否能够修饰或缓解与其他元素（包括有毒元素及高水平下可能产生不良影响的必需微量元素）相关的肝功能改变——这一关键问题在既往研究中被 largely 忽视。为增强生物学可解释性，研究人员还构建了AOP框架，将元素相关的分子扰动与下游肝脏结局相联系，以期推进对妊娠期元素混合物效应的理解，并为母体肝脏健康保护提供额外证据。
本研究的技术路线如下。研究纳入620名孕妇，这些对象来自2019年9月至2021年4月期间招募的无锡出生队列，纳入标准为单胎妊娠、计划在本研究医院分娩、无包括慢性肝病在内的主要既往慢性疾病。研究人员在妊娠中期采集母体静脉血样本，采用电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry, ICP-MS）定量检测20种元素的全血浓度；肝功能指标从电子病历中提取，包括ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、IBIL、ALB、TP、GLO和LDH共11项。统计分析采用广义线性模型（GLM）和分位数GLM评估单一元素与肝功能指标的关联，广义可加模型（GAM）评估潜在非线性关系；混合物效应通过分位数g计算（Qgcomp）、加权分位数和（WQS）回归以及贝叶斯核机器回归（Bayesian Kernel Machine Regression, BKMR）进行评估；交互作用和联合效应通过中位数分层后的乘性交互项和四分类联合暴露变量进行分析。AOP框架的构建基于比较毒理学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD）和GeneCards数据库，通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析筛选潜在MIE和KE，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并在Cytoscape中通过CytoHubba插件进行拓扑分析确定核心基因。
研究结果部分呈现了六个主要方面的发现。
**研究参与者特征**：620名孕妇的平均年龄为28.9岁，65.5%孕前BMI正常，20.3%超重或肥胖，65.0%具有大学或本科学历，58.4%为初产妇，86.1%报告孕前一年无饮酒行为。在20种检测元素中，13种检出率高于70%。受教育程度和收入水平较高的女性As、Se和Hg浓度较高，可能反映了海产品消费的差异；经产妇Zn水平显著低于初产妇，而Sr水平较高。
**单一元素与肝功能指标的关联**：GLM分析显示，Mn与AST、ALP和LDH正相关；Pb和Co与ALP升高正相关；Hg和Cd分别与ALT和LDH增加显著相关；Se与ALT和AST正相关，但与ALP负相关。相反，Ti与TBIL和DBIL呈负相关，Sr与ALT和GGT呈负相关。分位数分析进一步确认，Se和Hg最高四分位数组的ALT水平显著升高；Hg最高四分位数组还与AST和LDH升高相关；Pb第三和第四四分位数组ALP水平更高。GAM分析揭示了Pb与ALP、Se与ALT之间的非线性关联。
**元素混合物暴露对肝功能指标的影响**：Qgcomp模型显示，元素混合物总体与ALT、AST和LDH水平显著正相关；Hg在混合物中权重最大。WQS回归进一步确认混合物总体与ALT、AST、ALP和LDH的正向关联，Hg（27.3%）、Mn（20.7%）、Pb（51.3%）和Hg（31.9%）分别为ALT、AST、ALP和LDH的最高加权成分。BKMR分析进一步支持了混合物对ALT、AST、ALP和LDH的正向总体效应。
**显著元素的交互与联合效应**：基于单一元素和混合物分析，研究人员进一步考察了显示负向关联的Sr和Ti与显示正向关联的Se、Mn、Pb、Hg、Cd、Co之间的交互和联合效应。结果发现，在低Sr亚组中，Hg暴露与ALT、AST和LDH升高相关；高Co暴露与高Sr亚组的AST升高相关。联合暴露分析显示，与高Sr低Co相比，低Sr低Co组的ALT水平更高；低Sr高Hg组相对于高Sr低Hg参考组的ALT水平也升高。在Ti相关分析中，高Ti高Hg组相对于高Ti低Hg参考组表现出更高的LDH和AST水平，而低Ti低Co组相比高Ti低Co参考组LDH水平降低。连续变量交互分析证实Sr与Hg对ALT和AST存在显著交互作用。
**敏感性分析**：排除高龄产妇（≥35岁）后结果与主分析一致；将孕前饮酒缺失值作为独立类别处理后结果总体一致；排除主要妊娠并发症或进一步调整鱼虾水产品消费频率后，总体关联的两两关联模式基本未变；RCS分析进一步验证了GAM识别的暴露-反应模式；混合物分析中排除Cd（因低于检出限比例较高）后，Qgcomp和WQS结果与主分析基本一致。
**构建的AOP框架**：通过整合CTD和GeneCards数据库，研究人员识别了51个与6种选定元素和肝病均相关的重叠基因。GO和KEGG富集分析产生1755个GO条目和110条通路，其中10种表型和68条通路在CTD中已有报道与元素或肝病相关。经筛选的26个重叠基因中，9个基因在八种拓扑算法中均位列前十，被确定为潜在MIE。这些潜在MIE参与细胞分化、死亡等过程，脂质分解和代谢过程显著富集，HIF-1、p53和MAPK通路可能至关重要。以9个潜在MIE和71个潜在KE为基础构建的cAOP框架显示，选定元素暴露可能通过激活NF-κB和HIF-1信号通路引发氧化应激和炎症反应。在包含82个节点和379条边的相互作用网络中，TNF具有最高的度中心性（度=42），在71个潜在KE中出现频率最高，因此被确定为确定性MIE。最终构建的TNF介导AOP框架表明，关键元素暴露可能改变TNF相关信号并导致NF-κB通路失调，从而影响下游细胞反应和随后的肝脏改变。
讨论部分对研究结果进行了深入解读。研究人员指出，本研究的核心发现包括：多种有毒元素和高水平下可能产生不良影响的必需微量元素（Se、Mn、Pb、Hg、Cd、Co）与ALT、AST、ALP和LDH升高显著相关；Sr和Ti与肝功能指标呈负相关；Qgcomp和WQS回归一致显示元素混合物对ALT、AST和LDH的总体正向效应，其中Hg和Mn权重较大；Sr和Ti与Hg或Co暴露的肝功能指标关联存在修饰作用；计算AOP分析提示TNF-NF-κB信号轴的激活可能是元素相关肝损伤的重要机制。
研究人员特别讨论了多项关键发现。关于社会经济差异与元素暴露的关联，受教育程度和收入水平较高的女性As、Se和Hg浓度较高，这可能部分反映了海产品消费的膳食模式差异。关于Sr的潜在保护作用，这是首次报道的全血Sr水平与ALT和GGT的负向关联，与动物研究中Sr通过调节内质网应激改善非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）的证据相符。更重要的是，Sr对Hg相关肝功能改变的修饰作用表明，Sr可能作为Hg相关肝功能指标改变的潜在调节因子，这与某些微量元素可能影响元素相关生物学反应的证据一致。关于Ti的双重作用，Ti与TBIL和DBIL的负向关联提示其在胆红素代谢或肝脏氧化过程中的潜在作用，但Ti的相关交互作用在连续变量分析中未达统计学显著，因此应谨慎解读。关于AOP框架的生物学意义，TNF作为炎症的核心调控因子和NF-κB的强效激活剂，其介导的通路为理解元素相关肝损伤提供了机制假设，但需注意计算AOP分析旨在提供生物学背景和机制假设而非确立因果关系。
研究人员也坦承了本研究的局限性：横断面设计限制因果推断；单一时间点的元素和肝功能指标检测可能无法完全捕捉妊娠期暴露的动态变化；血液生物标志物对某些元素可能不如尿液标志物敏感；残余混杂因素如被动吸烟、其他膳食因素、妊娠期体重增长、维生素/矿物质补充及药物使用等无法完全排除；Logistic回归分析中较少关联具有统计学意义，提示观察到的关联可能主要反映亚临床生化改变。
**研究结论**：本研究表明，单一元素暴露和元素混合物均与孕妇肝功能指标的亚临床改变相关，其中Hg与肝功能指标升高的关联最为一致。混合物分析进一步支持了多种元素联合暴露对肝功能指标的整体效应，而交互分析为Sr在Hg相关肝功能改变中的潜在修饰作用提供了证据。AOP框架为这些流行病学发现提供了额外的生物学合理性支持。总体而言，这些结果凸显了环境元素暴露与母体肝功能之间的复杂关系，值得进一步的纵向研究和机制探究。
