代谢组学全关联分析鉴定与全氟烷基物质人体暴露相关的代谢物

《Journal of Exposure Science & Environmental Epidemiology》：Metabolome-wide association study identifies metabolites associated with human exposure to perfluoroalkyl substances

　　

全氟烷基物质（PFAS）是一类在环境中广泛存在且与多种健康效应存在 documented 关联的有机化合物。其病理生理学机制尚不明确，尽管已有迹象表明代谢通路可能参与其中。本研究旨在评估瑞典成年人群中血清PFAS浓度与代谢组之间的关联。研究人员开展了一项广泛的代谢组学全关联分析（MWAS），以探索EpiHealth队列2353名参与者血清代谢物与血清全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）和全氟己烷磺酸（PFHxS）浓度之间的潜在关联。采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）测定PFAS及790种 distinct 非外源性代谢物的水平。研究结果在POEM和PIVUS队列的1104名参与者中进行验证。线性回归模型调整了年龄、性别、体重指数（BMI）、吸烟、运动、教育和糖尿病等因素。结果显示，236种代谢物经FDR<0.05验证与PFOS显著相关，190种代谢物与PFOA显著相关。PFHxS未观察到可验证的显著关联。与PFOS和PFOA均表现出最强关联的代谢物为多种脂质相关代谢物，包括长链多不饱和脂肪酸（n3和n6）、饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸。此外，溶血磷脂酰胆碱（lysophospholipids）、鞘磷脂（sphingomyelins）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines）以及多种氨基酸也与这两种PFAS相关。代谢通路分析鉴定出支链氨基酸生物合成、不饱和脂肪酸合成及精氨酸生物合成通路的显著富集。

研究背景与存在问题

全氟烷基物质（PFAS）是一类自20世纪50年代起广泛应用于工业和消费产品的人工合成化学品。大多数PFAS具有环境持久性，可随时间累积并导致人群慢性暴露。尽管全球范围内已通过限制使用降低其暴露水平，但PFAS仍在地表水、地下水、土壤、植被、鱼类及畜禽中持续检出，构成持续的公共卫生问题。在瑞典，受军事消防活动或工业过程影响的地区地下水中PFAS浓度升高尤为值得关注。大量流行病学研究已证实PFAS暴露与多种不良健康效应相关，包括心血管代谢疾病和代谢相关终点事件，但这些关联的分子机制迄今仍不清楚，尽管近期研究提示脂质代谢改变可能发挥重要作用。

代谢组学（metabolomics）作为连接基因、蛋白质、信号过程与细胞环境终末产物的关键工具，在环境毒理学和风险评估中具有重要应用价值。代谢组学全关联分析（MWAS）能够系统识别环境化学物暴露的代谢标志物，为理解人群环境暴露后的分子响应提供关键信息。既往虽有研究探讨PFAS暴露与代谢组学的关联，涉及脂肪酸代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢及磷脂代谢等通路，但多数研究缺乏外部队列验证，限制了结果的可靠性。

基于此，本研究旨在通过大规模发现-验证策略，在瑞典代表性成年人群中系统识别与PFAS暴露相关的代谢标志物，以克服既往研究样本量有限、缺乏独立验证的不足，为PFAS健康效应的生物学机制研究提供高质量证据。

研究设计与关键技术方法

本研究采用两阶段设计：发现阶段基于EpiHealth队列2353名45-75岁参与者，验证阶段纳入POEM队列501名50岁参与者和PIVUS队列603名80岁参与者进行独立验证。暴露评估采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）（Metabolon公司）对生物样本库中-70至-80°C保存的血清样本进行相对定量检测，检测PFOS、PFOA和PFHxS三种PFAS。代谢组学检测同样采用非靶向UPLC-MS/MS平台，涵盖反向色谱正/负离子模式及亲水作用色谱负离子模式，鉴定791种unique内源性代谢物。统计分析采用逆秩正态化处理后，以线性回归模型分析代谢物与PFAS的关联，调整年龄、性别、BMI、教育水平、运动习惯、吸烟和糖尿病等混杂因素，采用错误发现率（FDR）<5%控制多重比较。验证阶段采用逆方差加权固定效应模型进行meta分析，最终通过MetaboAnalyst 6.0进行基于KEGG数据库的代谢通路富集分析。

研究结果

基线特征与PFAS暴露检出情况

EpiHealth发现队列中，2353名参与者（女性49.4%，男性50.6%）平均年龄61.1±8.40岁，平均BMI 26.5±3.8 kg/m²，10%有吸烟史，50%受过大学及以上教育。PIVUS验证队列603名参与者均为80岁，BMI中位数26.9±4.5 kg/m²，8%吸烟，27%受过大学教育，12%患2型糖尿病。POEM验证队列501名参与者年龄50±0.1岁，BMI中位数26.4±4.2 kg/m²，10%吸烟，48%受过大学教育，2%患2型糖尿病。三种PFAS在各队列中检出率高达97%-100%，与瑞典人群PFAS暴露普遍存在的既往报告一致。

PFOS与PFOA的代谢组学全关联分析

在EpiHealth发现队列中，359种代谢物与血清PFOS浓度显著相关（FDR<0.05），其中236种（65%）在POEM和PIVUS队列验证成功。关联最强的正向关联见于长链脂肪酸和磷脂类物质，包括硬脂酸酯（stearate, 18:0）、二十碳五烯酸酯（eicosapentaenoate, EPA; 20:5n3）、二十二碳六烯酸酯（docosahexaenoate, DHA; 22:6n3）及2-棕榈酰-GPC（16:0）；最显著负向关联涉及氨基酸衍生物果糖赖氨酸（fructosyl-lysine）、血红素（heme）、2-甲基丝氨酸（2-methylserine）及1-棕榈酰-2-二高-亚麻油酰-GPC（16:0/20:3n3或6）。

329种代谢物与PFOA显著相关，其中190种（57%）验证成功。最强正向关联包括DHA（22:6n3）、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸酯（CMPF）、二十一碳五烯酸酯（heneicosapentaenoate, 21:5n3）、EPA（20:5n3）、硬脂酸酯（18:0）及二十二碳五烯酸酯（n3 DPA; 22:5n3）。最强负向关联为鞘磷脂（sphingomyelin, d18:2/24:2）、1-(1-烯基-棕榈酰)-2-亚油酰-GPE（P-16:0/18:2）、1-油酰-2-亚油酰-GPE（18:1/18:2）、1,2-二亚油酰-GPC（18:2/18:2）及多巴胺-4-硫酸酯（dopamine 4-sulfate）。

PFOS与PFOA关联代谢物的比较分析揭示显著重叠：128种代谢物同时与两种暴露相关，108种和62种分别unique于PFOS和PFOA。火山图可视化显示，独特关联代谢物呈现不同的代谢模式，而共享代谢物主要富集于脂质和氨基酸相关通路。

PFHxS的代谢组学分析

发现队列中101种代谢物与PFHxS显著相关，但无一种能在验证队列中重现（FDR<0.05）。仅5种代谢物显示名义显著性（P<0.01），包括支链14:0二羧酸、2-氨基辛酸酯、吡哆酸酯、羟基-N⁶,N⁶,N⁶-三甲基赖氨酸（负向关联）及吲哚丙酸酯。

代谢通路富集分析

基于验证代谢物的通路富集分析显示，PFOS相关代谢物显著富集于两个通路：不饱和脂肪酸生物合成（FDR校正P=8.22×10^-8）和缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸生物合成（即支链氨基酸生物合成，FDR校正P=3.20×10^-5）。PFOA相关代谢物同样富集于上述两个通路（FDR校正P分别为8.3×10^-4和5.9×10^-3），并且额外富集精氨酸生物合成通路（FDR校正P=0.019）。这些结果共同表明脂质代谢和氨基酸代谢是PFAS暴露的关键代谢通路。

讨论与结论

本研究通过三队列、逾3000名参与者的大规模发现-验证策略，系统描绘了与PFAS人体暴露相关的循环代谢物图谱，显著提升了既往单队列研究的可靠性。236种PFOS相关和190种PFOA相关代谢物获得跨队列验证，且大量关联方向一致，提示两种全氟化合物对代谢的影响具有相似性。与之形成鲜明对比的是，PFHxS关联无法验证，这可能反映不同PFAS与机体代谢相互作用的差异，也可能源于两阶段FDR校正的严格性——部分PFHxS关联虽具名义显著性但未达多重检验阈值。

多数显著PFAS-代谢物关联为正向关联，即暴露水平升高伴随代谢物水平升高，这一整体模式可能反映高暴露个体脂质或肝脏代谢的广泛改变，值得在实验和流行病学研究中深入探索。

与既往28余项观察性研究的系统比较显示，本研究结果与PFAS主要关联脂质和氨基酸代谢的共识高度一致，涵盖了色氨酸代谢、尿素循环、甘油磷脂代谢及脂肪酸氧化等关键通路。特别值得关注的是，近期一项纳入3647名参与者的大型研究同样发现PFOS和PFOA与多种代谢物（尤其脂质和外源性物质）的显著关联，与本研究发现相互印证。

从疾病关联角度，PFAS水平升高与糖尿病和心血管疾病（CVD）的关联已较为明确。本研究发现的富集通路——支链氨基酸生物合成、不饱和脂肪酸合成和精氨酸生物合成——具有重要的病理生理学意义：支链氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）循环水平升高与2型糖尿病风险增加相关；L-精氨酸是一氧化氮的前体，而后者对血管功能和 integrity 至关重要；不饱和脂肪酸替代饱和脂肪酸可降低CVD风险。因此，PFOS和PFOA的代谢特征可能与CVD和糖尿病风险增加存在生物学相容性。

本研究的主要优势包括大样本量、广泛的代谢物覆盖范围以及独立队列的验证策略。局限性在于PFAS为相对定量而非绝对定量（尽管前期研究证实与定量测量相关性良好）；通路分析受限于验证代谢物数量及KEGG/HMDB数据库的覆盖范围；残余混杂和横断面设计无法建立因果推断；研究对象主要为老年人，结果向年轻人群的推广受限；此外，白蛋白作为脂肪酸和PFAS的血清转运蛋白，其水平可能调节脂肪酸与PFAS的关联，但各队列未测量白蛋白浓度，这一潜在混杂有待未来研究澄清。

研究结论：本研究通过大样本量和严格的验证策略，全面分析了与PFAS暴露（尤其PFOS和PFOA）相关的循环代谢物。研究鉴定并验证了PFAS暴露与脂质和氨基酸代谢相关代谢物之间的显著关联，进一步强化了PFAS与这些代谢通路之间的联系。然而，PFHxS关联未能得到验证，凸显了进一步研究的必要性。尽管横断面设计和残余混杂限制了因果推断，但这些结果为未来环境毒理学和风险评估研究提供了有价值的见解。该论文发表于《Journal of Exposure Science》。